一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，该方法的主要步骤包括(1)crRNA的设计、转录和纯化；(2)通用探针在纳米粒子上的标记；(3)Linker探针的制备；(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应；(5)纳米粒子的显色反应与结果读取。本发明专利技术还包括基于该方法的一种试剂盒及其应用。本发明专利技术可以实现裸眼室温均相检测，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点，其成本廉价及较强通用性有利于现场检验与基层医疗系统的推广。

A universal colorimetric nucleic acid detection method and kit based on CRISPR / CAS system and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用
本专利技术涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，人类面对的威胁也越来越多。人类渴望能够快速鉴定病原微生物的检验技术和试剂，来区分种类繁多且变异迅速的病原微生物，面对鱼龙混杂的转核酸食品，人类也迫切希望能够快速甄别转核酸食品的含量与危害。然而传统实验室检测方法操作繁琐，周期长，依赖一些高精尖仪器，且对操作人员的技术水平要求比较高，并不能很好满足人类的需求。因此无论从哪种方面均亟需发展通用、简单和经济的生物传感技术来准确进行核酸鉴定，从而采取相应措施，避免造成损失。随着胶体金诊断技术的发展，相对快速准确的胶体金试纸条在生物检测领域得到了很大的发展应用。尽管其在快速检测应用上有很大的空间，但是，这种检测方法针对每种不同的检测核酸都要重新设计相应的抗体或捕获探针，提高了使用成本，在通用性上也大打折扣。近年来，一种名为CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)的基因编辑技术迅速发展，这项技术不但可以应用于DNA编辑，而且也已被扩展到了RNA编辑领域。在CRIAPR技术中，CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a具有两种不同的催化能力，被用于特定的DNA/RNA靶基因识别。它们可以在识别靶基因的情况下，不仅对靶标基因有剪切作用，同时对反应体系中的其他单链DNA或RNA也进行剪切。但这种方法在基因检测方面的应用往往依赖于电泳技术和荧光定量技术，同样面临着基层一线推广难、检测成本高的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，具体包括以下步骤：(1)crRNA的设计、转录和纯化：crRNA探针的设计：如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计。crRNA探针的转录：根据设计好的crRNA序列进行体外转录。crRNA探针的纯化：将转录产物采用市售的相关纯化试剂盒进行纯化。(2)通用探针在纳米粒子上的标记：所述纳米粒子为具有距离效应产生光学性质变化的纳米粒子；所述通用探针至少为一种，且其序列的一端带有修饰基团或一段多聚A或者其他亲和序列，使其能够标记到纳米粒子上从而得到标记有通用探针的纳米粒子溶液。所述纳米粒子包括但不限于纳米金、磁珠、荧光微球、量子点、上转换纳米粒子等。所述的修饰基团包括但不限于巯基、生物素等。所述标记方法包括但不限于冷冻法、盐标法、pH法等。(3)Linker探针的制备：所述Linker探针至少为一种，且其与步骤(2)所述通用探针存在部分互补序列，两者通过杂交可使纳米粒子交联变色；如果靶核酸为DNA则所述Linker探针为DNA序列，如果靶核酸为RNA则所述Linker探针为RNA序列。(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应：将待测样品的核酸与步骤(3)得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应；如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物；如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物；所述crRNA为步骤(1)得到的产物。(5)纳米粒子的显色反应与结果读取：将步骤(4)所述剪切反应的产物与步骤(2)所述标记有通用探针的纳米粒子溶液进行反应，放置一段时间后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理，如果溶液颜色不发生变化或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色变为无色或透明，则待测样品中不含目的核酸。显色反应混合液放置一段时间后可进行特殊处理，可以使显色对比结果更快更显著，所述特殊处理方法为离心、过滤、加热和冷冻处理中的任一种，其中离心和过滤是为了除去混合溶液中已经交联聚集的纳米粒子颗粒的影响；加热或冷冻处理是为了加快纳米粒子颗粒的交联聚集速度，使显色更快。如果溶液的颜色变浅，说明待测核酸的浓度比较低，但此时仍然可以确定待测核酸中含有目的核酸。优选地，步骤(2)所述的纳米粒子为胶体金。所述胶体金的粒径大小为5nm-50nm，所述胶体金的浓度要求为1nM-50nM。进一步地，步骤(2)所述的通用探针为至少含有5个碱基A的多聚A序列。多聚A可以吸附在胶体金表面使得探针可以标记到胶体金颗粒上。进一步地，步骤(2)所述的通用探针为两种不同的探针，分别标记在胶体金上；步骤(3)所述Linker探针为一种，且与两种通用探针都存在部分互补序列，能够通过杂交作用使胶体金交联变色。更进一步地，步骤(5)所述显色反应具体为：预混，将标记了两种不同探针的胶体金按1:1的比例混匀；显色，将步骤(4)所述的剪切反应产物加入到预混好的胶体金中，所述反应产物与预混好的胶体金比例为1:3，放置5min后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理；如果溶液颜色仍为红色或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色由红色变为无色，则待测样品中不含目的核酸。进一步地，如果步骤(5)所述显色反应的颜色区分不明显，可通过测量混合溶液在纳米粒子最大吸收峰处的紫外吸收值来进行判断，所述吸收值大于检测限则视为含有目的核酸。最大吸收值的测量与所选的纳米粒子相关，选取该纳米粒子最大吸收值处波长进行测量。在测量最大吸收值的分析中，只要待测核酸的最大吸收值高于检测限，我们就可以判定，待测样品中含有目的核酸。检测限是待测样品中目的核酸能被检测出的最低量，用以表示测定方法在所述条件下对待测样品中目的核酸的最低检出浓度。更进一步地，所述检测限为阴性标准品产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。阴性标准品是将水作为待测样品，不含目的核酸，测量其显色液的吸收值大小，为了避免误差，通常多组实验测量后取平均值，计算得到检测限。本专利技术还包括一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测试剂盒，采用以上所述检测方法进行检测，包含A、B两个分试剂盒：A分试剂盒包括CRISPR/Cas系统的剪切反应所需的Cas12a蛋白/crRNA复合物和/或Cas13a蛋白/crRNA复合物、对应的Cas12a蛋白反应buffer和/或Cas13a蛋白反应buffer、胶体金LinkerDNA和/或LinkerRNA及其他相关试剂；B分试剂盒包括已标记两种不同通用探针的胶体金混合液，所述两种通用探针能够与A分试剂盒中所述胶体金Linker进行杂交从而使胶体金交联变色。...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，具体包括以下步骤：/n(1)crRNA的设计、转录和纯化；如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计；/n(2)通用探针在纳米粒子上的标记；所述纳米粒子为具有距离效应产生光学性质变化的纳米粒子；所述通用探针序列的一端带有修饰基团或一段多聚纳米粒子亲和序列，使其能够标记到纳米粒子上从而得到标记有通用探针的纳米粒子溶液；/n(3)Linker探针的制备；所述Linker探针与步骤(2)所述通用探针存在部分互补序列，两者通过杂交可使纳米粒子交联；/n(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应；将待测样品的核酸与步骤(3)得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应，如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物，如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物，所述crRNA为步骤(1)得到的产物；/n(5)纳米粒子的显色反应与结果读取；将步骤(4)所述剪切反应的产物与步骤(2)所述标记有通用探针的纳米粒子溶液进行反应，放置一段时间后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理，如果溶液颜色不发生变化或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色变为透明或无色，则待测样品中不含目的核酸。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，具体包括以下步骤：
(1)crRNA的设计、转录和纯化；如果靶核酸为DNA则根据Cas12a蛋白的识别机理进行设计，如果靶核酸为RNA则根据Cas13a蛋白的识别机理进行设计；
(2)通用探针在纳米粒子上的标记；所述纳米粒子为具有距离效应产生光学性质变化的纳米粒子；所述通用探针序列的一端带有修饰基团或一段多聚纳米粒子亲和序列，使其能够标记到纳米粒子上从而得到标记有通用探针的纳米粒子溶液；
(3)Linker探针的制备；所述Linker探针与步骤(2)所述通用探针存在部分互补序列，两者通过杂交可使纳米粒子交联；
(4)CRISPR/Cas系统的剪切反应；将待测样品的核酸与步骤(3)得到的Linker探针置于CRISPR/Cas系统中进行剪切反应，如果靶核酸为DNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas12a/crRNA复合物，如果靶核酸为RNA时，CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白/crRNA复合物为Cas13a/crRNA复合物，所述crRNA为步骤(1)得到的产物；
(5)纳米粒子的显色反应与结果读取；将步骤(4)所述剪切反应的产物与步骤(2)所述标记有通用探针的纳米粒子溶液进行反应，放置一段时间后将显色反应混合液进行离心、过滤、加热或冷冻等处理，如果溶液颜色不发生变化或颜色变浅，则待测样品中含有目的核酸；如果溶液颜色变为透明或无色，则待测样品中不含目的核酸。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的纳米粒子为胶体金。


3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的通用探针为至少含有5个碱基A的多聚A序列。


4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的通用探针为两种不同的探针，分别标记在胶体金上；步骤(3)所述Linker探针为一种，且与两种通用探针都存在部分互补序列，能够通过杂交作用使...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，元超群，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44