多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准曲线，得标准工作曲线方程；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的浓度；(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率。本发明专利技术实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风蛋白涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。本发明专利技术不仅可以检测残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。

Determination of binding rate of polysaccharide protein binding site in polysaccharide protein binding vaccine

【技术实现步骤摘要】
多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法
本专利技术涉及一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，属于疫苗质量评价

技术介绍
多糖蛋白结合疫苗是将多糖通过化学键与蛋白结合后形成的一类疫苗。用于多糖蛋白结合疫苗的蛋白称为蛋白载体。常用蛋白载体有CRM197蛋白，白喉类毒素(即甲醛脱毒的白喉蛋白)和破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)。常见的多糖蛋白结合疫苗包括四价脑膜炎疫苗(A、C、W、Y)，Hib疫苗和13价肺炎多糖疫苗(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有不同的免疫用途。如23价肺炎疫苗(多糖疫苗)用于2岁以上儿童和成人，对2岁以下儿童免疫效果较差，而13价肺炎疫苗(多糖蛋白结合疫苗)由于有蛋白载体辅助作用，可以很好的激发2岁以下儿童T细胞的免疫反应，从而达到预防多种肺炎病毒入侵的作用。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有制备工艺更复杂，质量控制更困难的问题。多糖蛋白结合疫苗往往需要先生产出质量良好的多糖疫苗和蛋白载体，再通过化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或CRM197蛋白为载体的疫苗，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；/n(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；/n(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；/n(4)绘制...

【技术特征摘要】
1.一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或CRM197蛋白为载体的疫苗，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；
(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；
(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；
(4)绘制标准曲线：各特征肽段峰的峰面积与特征肽段的浓度呈线性关系，各特征肽段的浓度与蛋白溶液的浓度相同；配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，通过步骤(1)、(2)、(3)得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A＝aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；
(5)样品检测：取待检测的多糖蛋白结合疫苗样品溶液，进行步骤(1)、(2)、(3)，得各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；
(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：
多糖结合位点N的多糖结合率W％＝(样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度)/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
多糖结合位点N的蛋白残留率C％＝特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
N代表某一特征肽段；数值最小的C％作为该样品中残留蛋白率。


2.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作如下：
①取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；
②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入胰蛋白酶，或：加入胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液，37℃反应4～20小时；
⑤加入酸液，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。


3.根据权利要求1或2所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGestTM；
或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；
或/和：所述碳酸氢铵溶液的浓度为10～500mmol/L；
或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L；
或/和：所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸。


4.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中，固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相(WAX)、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相(SAX)、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相(C18WAX)、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相(C18SAX)、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合弱阴离子交换固定相(C8WAX)、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合强阴离子交换固定相(C8SAX)；
流动相为酸液-有机溶剂混合液；
所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸；
所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的任意一种或两种以上；
或/和：所述酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：龙珍，李茂光，李月琪，李亚南，李长坤，毛琦琦，黄涛宏，许美凤，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11