破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法技术

本发明专利技术公开了一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准特征肽段表，得到标准品种各特征肽段相对响应强度；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的相对响应强度、回收率；(6)根据特征肽段回收率良好的肽段数目对脱毒效果进行评价。本发明专利技术的监测方法，首次实现了定量监测破伤风类毒素、白喉类毒素工艺稳定性的方法，解决甲醛脱毒蛋白的工艺缺乏监测方法的问题，将为破伤风疫苗、白破二联、百白破三联、五联苗、多糖蛋白结合疫苗的生产优化和新型多糖蛋白结合疫苗的研发提供有效的定量数据，加快疫苗质量提升进程和新产品研发。

【技术实现步骤摘要】
破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法
本专利技术涉及一种破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或白喉类毒素(即甲醛脱毒的白喉蛋白)的监测方法，属于疫苗质量评价

技术介绍
化学脱毒是疫苗常见的生产工艺，通过甲醛或戊二醛与蛋白的作用，减少蛋白的毒性而保留其免疫原性。化学脱毒的外毒素蛋白和外膜蛋白可直接作为疫苗的主要成分，如甲醛脱毒的白喉蛋白(白喉类毒素)和甲醛脱毒的破伤风蛋白(破伤风类毒素)。两者与甲醛(戊二醛)脱毒的百日咳鲍特氏菌蛋白按比例配置成为百白破疫苗。甲醛脱毒的蛋白还可作为疫苗生产的原料，如破伤风类毒素或白喉类毒素可作为多糖蛋白疫苗的载体蛋白。多糖蛋白结合疫苗是将多糖通过化学键与蛋白结合后形成的一类疫苗。用于多糖蛋白结合疫苗的蛋白称为蛋白载体。常用蛋白载体有破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197。常见的多糖蛋白结合疫苗包括四价脑膜炎疫苗(A、C、W、Y)，Hib疫苗和13价肺炎多糖疫苗(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有不同的免疫用途。如23价肺炎疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素或白喉类毒素标准品溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；/n(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；/n(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；/n(4)计算特征肽段相对响应强度：以峰面积最高的特征肽段的峰面积为分母，以特征肽段的峰面积为分子，得到各特征肽段相对响应强度(...

【技术特征摘要】
1.一种破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素或白喉类毒素标准品溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；
(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；
(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；
(4)计算特征肽段相对响应强度：以峰面积最高的特征肽段的峰面积为分母，以特征肽段的峰面积为分子，得到各特征肽段相对响应强度(I％标)；
(5)样品检测：取待检测的破伤风类毒素或白喉类毒素样品溶液，进行步骤(1)、(2)、(3)、(4)，得各特征肽段的相对响应强度(I％样n)；根据下述方程计算样品中特征肽段n的回收率(Rn％)：Rn％＝I％样n/I％标nx100％；
(6)判断：Rn％大于100％，说明样品中特征肽段n脱毒程度小于标准品中相应特征肽段的脱毒程度；Rn％小于100％，说明样品中特征肽段n脱毒程度大于标准品中相应特征肽段的脱毒程度；
或/和：Rn％在80％～120％之间为重复性良好肽段，根据Rn％良好的肽段数目对脱毒效果进行评价：Rn％良好的特征肽段数目占总肽段数目的80％及以上，60％及以上和60％之下分别为良好、合格和有待改进。


2.根据权利要求1所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤(1)对照品的酶解的具体操作如下：
①取破伤风类毒素或白喉类毒素溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；
②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入蛋白酶，或加入碳酸氢铵溶液和蛋白酶，25～37℃酶解4～20小时；
⑤加入酸液，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。


3.根据权利要求1或2所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGestTM；
或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；
或/和：所述碳酸氢铵溶液的浓度为10～500mmol/L；
或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L；
或/和：所述蛋白酶选自胰蛋白酶、糜蛋白酶；
或/和：所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸。


4.根据权利要求1或2或3所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作如下：
①取100μL破伤风类毒素或白喉类毒素溶液，加入100蛋白变性剂，60℃孵育15分钟；
②加入10μL二硫键断裂试剂溶液，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入10μL的1mol/L的碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入765μL的50mmol/L的碳酸氢铵溶液，以及5μL的0.1mg/mL的胰蛋白酶溶液或糜蛋白酶溶液，37℃或25℃酶解4～20小时；
⑤加入5μL的酸液，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。


5.根据权利要求1所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，固相萃取柱的固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相。


6.根据权利要求1所述的破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，流动相为酸液-有机溶剂混合液；
所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸；
所述有机溶剂选自甲醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙珍，卫辰，马霄，李月琪，谭亚军，李茂光，李长坤，黄涛宏，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11