一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用，该体系利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对。长寿命荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团；受体分子是一种具备高摩尔消光系数和高荧光量子产率的有机荧光染料，其摩尔消光系数大于等于250,000cm

【技术实现步骤摘要】
一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用
本专利技术涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及应用，属于免疫分析领域。
技术介绍
半个多世纪以来，主流的免疫检测技术历经放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等阶段，放射免疫分析由于放射性问题目前用量已经很少，酶联免疫分析由于检测时间长正逐渐被替代，化学发光免疫分析是目前的主流免疫分析技术。在急诊等即时检测领域，化学发光由于技术复杂和成本高而难以广泛运用，这些需求催生了即时检测类免疫检测技术，如胶体金免疫分析、荧光层析免疫分析、胶体比浊免疫分析等，但是即时检测免疫分析技术存在精度差的共同问题，仅能作为辅助初筛检测手段，最终还需要化学发光免疫分析来确认。化学发光免疫分析技术诞生于上世纪七十年代，采用的主流技术是磁微粒化学发光，其核心假设在于“通过磁分离一定可以实现特异性免疫复合物和生物基质的分离”，但在临床实际应用中，由于临床标本的多样性，不可避免出现磁分离失效的案例，例如纤维蛋白黏连引起非特异性吸附导致的“跳值”现象，以及异嗜性抗体导致的假阳性等。对仪器自身而言，一半的故障是磁清洗故障引起的。因此免清洗的免疫分析技术近二三十年一直是研究热点，西门子、贝克曼等公司都有相关技术储备，国内企业北京科美生物公司基于西门子专利光激化学发光技术推出一系列高通量免疫分析系统，首次实现了免清洗检测在临床的应用，这一技术存在的问题在于发射光在不同样本中透过率存在较大差异，当检测溶血、高血脂样本时准确度较差。时间分辨荧光共振能量转移免疫分析技术(time-resolvedFRET,TR-FRET)，最早由德国勃拉姆斯(brahms)公司基于法国诺贝尔化学奖得主Jean-MarieLehn发现的超分子稀土穴醚探针开发而成，克服了均相检测中由于溶血、高血脂、黄疸等样本异常对准确度的影响。与其他免疫检测技术相比具有众多优势，该技术无需固相载体与固相探针，精密度和准确度好，操作简单，易于自动化和微型化等等。时间分辨荧光共振能量转移方法的核心是两个荧光分子，分别叫供体和受体，其中供体可以吸收激发光，自身可以发出荧光，也可以通过荧光共振能量转移方式传递给受体，由受体发出荧光。只有两种荧光分子很好配合，发生免疫反应时，才能产生明显的信号。具体而言，其是利用具有穴状结构的稀土元素的螯合标记物作为荧光供体，以及与荧光供体具有良好光谱重叠的短寿命荧光分子作为荧光受体，在稀土元素穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间发生荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命接近供体的发射荧光的寿命。因为供体荧光衰减周期较长，所以供体会诱导受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。具体原理是：如图1所示，当生色团被光照射时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态。光能可被生色团在10-15秒内吸收而在10-9秒内再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这后一种现象称为荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。因此，FRET发生的基本条件是：(1)供体和受体的距离必须达到一定的数量级(2-10nm)；(2)受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；(3)供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。只有当两个分子间距离满足FRET发生基本条件时，光源(闪烁氙灯或者激光或者脉冲LED)激发的供体会将能量转移给受体，从而发出特定波长的荧光。由于以上光谱特性，不需要物理分离未结合分子，即可检测到表明“供体-受体复合物”形成的特异性FRET信号。真正的均相检测不需要任何诸如离心、清洗、过滤、层析或者磁分离之类的分离步骤。荧光供体和受体可以共价连接到不同的配对分子上，例如，蛋白二聚体、DNA互补链、抗原和抗体、配体和受体等。传统的FRET荧光化合物容易受到样品(血清、血浆、缓冲液、蛋白质、化学物质和细胞裂解液)背景荧光干扰。这种背景荧光的寿命极短(10-9秒量级)，很容易通过时间分辨的方法去除这种干扰。时间分辨荧光共振能量转移(time-resolvedFRET,TR-FRET)技术结合了FRET技术和时间分辨荧光测量，去除了极短寿命的背景荧光。瞬时的光激发后，延迟50-150微秒后非特异性短寿命发射光降为零。而TR-FRET荧光团发出长寿命荧光参与FRET过程。因此长寿命受体发射光代表了分子结合时的能量转移。分子邻位特性决定了只有当供体和受体的距离足够小时才会发生FRET效应。Forster半径(Forster’sradius)R0为FRET效率为50％时供受体之间的距离，是FRET系统的特征参数。均相时间分辨荧光免疫分析(HomogenousTime-ResolvedFluorescenceImmunoassay,HTR-FIA)的R0为7-9.5nm，基于具有镧系元素的供体与高效受体之间的荧光共振能量转移。在FRET中，高效受体发射荧光的寿命等同于镧系元素供体发射荧光的寿命。目前临床应用的均相时间分辨荧光配对主要由法国cisbio公司提供的，被德国brahms公司用于临床。brahms公司采用的两种荧光分子分别是：供体是小分子的Eu-TBP，是一种元素铕的三联吡啶笼状分子，见图2。受体是大分子荧光蛋白，别藻蓝蛋白APC的一种，商品名XL665。有关技术文献有：文献1.RareEarthCryptatesandHomogeneousFluoroimmunoassayswithHumanSera,CLIN.CHEM.39/9,1953-1959(1993)文献2.USPATENT5,512,493XL665存在的主要问题是分子量大，空间结构位阻大，导致反应速度慢；XL665同时也会发出620纳米荧光，与供体有重叠。均相时间分辨荧光免疫分析技术应用于临床，还需要解决一系列干扰问题，两种荧光分子的发射波长应当不受临床标本的影响，目前满足临床需求的检测波长主要有620nm和665nm，其中检测波长为620nm的探针，主要是稀土荧光探针，作为荧光共振能量转移的供体，检测波长为665nm的探针，可以是小分子荧光探针和大分子荧光蛋白，作为荧光共振能量转移的受体。
技术实现思路
为了克服传统的荧光共振能量转移，采用的荧光分子寿命都很短，因此检测灵敏度比较差的问题，本专利技术提供一种时间分辨荧光共振能量转移体系，利用了时间分辨的高灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于，/n利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；/n高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对。/n

【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于，
利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；
高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对。


2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于，所述的长寿命荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团；受体分子是一种具备高摩尔消光系数和高荧光量子产率的有机荧光染料，其摩尔消光系数大于等于250,000cm-1M-1，荧光量子产率≥28％。


3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于，所述的笼状稀土铕配合物，为方便标记，氨基引入马来酰亚胺和琥珀酰亚胺；加入氟离子，与Eu3+形成配位，增强偶极矩、改善荧光；氟离子在反应体系中终浓度10-900mM。


4.根据权利要求2所述的时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于，所述的笼状稀土铕配合物，氟离子在反应体系中终浓度为50-600mM。


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【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32