一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于细胞上皮‑间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于分子生物学和生物传感器制备技术领域。本发明专利技术制备得到的电化学生物传感器能够专门检测EMT的标志蛋白(E‑钙粘蛋白)的变化，并能够有效地分析EMT的不同阶段。由于分子信息传输到电子设备，EMT的信号被大大放大。同时由于QD和碳纳米管‑金纳米颗粒的协同作用，使用差分脉冲伏安法检测时，电化学信号的响应快速且灵敏，能够有效推动电化学生物传感技术应用于复杂生物学行为的研究，因此具有良好的实际应用之价值。

An electrochemical biosensor for the detection of epithelial mesenchymal transition and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学和生物传感器制备
，具体涉及一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。上皮-间充质转化(EMT)在多种生物过程中发挥重要作用，如胚胎发育，组织生长和伤口愈合等等。越来越多的证据表明EMT在肿瘤进展中起关键作用，EMT会促进良性肿瘤细胞向周围组织的浸润并转移到远处的部位。在EMT发生期间，上皮细胞失去极性和细胞间连接，呈现细长的形态，并获得细胞运动能力。许多分子，如作为转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)，已被确定能够诱发EMT的发生。此外，EMT过程中涉及几个分子事件，包括：转录因子的激活、表达特定的蛋白质以及细胞骨架的重排。目前EMT主要通过传统方法进行检测，如Westernblotting和免疫荧光显微镜。但是，专利技术人发现，上述方法存在包括检测时间长，步骤繁琐，成本高等缺陷。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用，所述电化学生物传感器能够专门检测EMT的标志蛋白(E-钙粘蛋白)的变化，从而能够有效地分析EMT的不同阶段。本专利技术中，由于分子信息传输到电子设备，EMT的信号被大大放大，同时由于CdSe/ZnS量子点(QD)和碳纳米管-金纳米颗粒的协同作用，使用差分脉冲伏安法检测时，电化学信号的响应快速且灵敏，且基于QD的独特性能，可以在检测电化学信号的同时实现荧光检测。因此本专利技术技术方案具有良好的实际应用之价值。本专利技术基于以下技术方案实现上述技术目的：本专利技术的第一个方面，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒(CNT-AuNP)改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针。本专利技术的第二个方面，提供上述用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备；和，E-cad-抗体-QD探针的制备。其中，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备方法包括：将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。所述E-cad-抗体-QD探针的制备方法包括：向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在室温下搅拌处理1～2小时进行缀合反应，经纯化后即得。本专利技术的第三个方面，提供上述电化学生物传感器在细胞上皮-间质转化检测中的应用。本专利技术的第四个方面，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的方法，所述方法包括使用所述电化学生物传感器基于电化学和荧光信号检测E-钙粘蛋白的变化进而分析细胞上皮-间质转化；具体的，羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极为工作电极，以Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极，铂丝作为对电极，连接至电化学工作站，Hg2+-乙酸缓冲液溶液作为支持电解液，将待测样品与E-cad-抗体-QD探针进行孵育后，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行电化学检测；同时基于免疫荧光技术进行荧光检测。本专利技术的优点和积极效果：本专利技术设计一种新型电化学生物传感器，能够使用E-钙粘蛋白作为生物标志物检测EMT。QD和CNT-AuNP纳米复合材料用于增强EMT生物传感器的灵敏度。本专利技术制备的EMT电化学生物传感器具有优于常规方法的若干优点。首先，EMT生物传感器中含有的E-cad-抗体探针可以特异性识别活细胞中的E-钙粘蛋白。因此，EMT生物传感器可以在不同时间点区分TGFβ处理后的EMT阶段。此外，由于QD的独特性能，可以在检测电化学信号的同时实现荧光检测。最后，电化学EMT生物传感器是检测原位细胞中EMT的理想选择，检测时间短，灵敏度高。电化学检测不需要细胞裂解、固定和二抗孵育，从而节省时间和成本。与传统标准方法相比，本专利技术制备的电化学生物传感器可以在更短的时间内检测EMT，并且在活细胞中具有更高的灵敏度。同时，本专利技术电化学生物传感器可以扩展到各种细胞过程，如细胞迁移、细胞凋亡、坏死、多药耐药性和其他相关领域，能够有效推动电化学生物传感技术应用于复杂生物学行为的研究，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例1使用A549细胞建立EMT模型，基于EMT生物传感器的电化学检测流程图；其中图1(a)为用E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，ZO-1，波形蛋白和α-微管蛋白抗体通过蛋白质印迹分析TGFβ处理前后的A549细胞图；图1(b)为EMT前后A549细胞的明视野图像；图1(c)为在TGFβ诱导之前和之后的A549细胞中的Transwell侵袭测定图(比例尺，200μm)；图1(d)为TGFβ处理前后视野中细胞数的统计分析图；图1(e)为通过免疫荧光显微术(比例尺，10μm)检测E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，ZO-1，波形蛋白和α-微管蛋白水平图。图2为本专利技术实施例1中的纳米复合材料的形态，结构和电化学性能的表征图；其中，图2(a-c)AuNP(a)，CNT(b)和CNT-AuNP(比例尺，50nm)的透射电子显微镜图像；图2(d)为CNT-AuNP的X射线衍射图谱；图2(e)是以50mV/s的扫描速率记录在10mMK3[Fe(CN)6]中的裸GCE，CNT/GCE和CNT-AuNPs/GCE的循环伏安曲线图；图2(f)为CNT-AuNPs/GCE的动力学分析图，扫描速率范围为10-100mV/s，表明修饰电极的反应是扩散控制的表面反应；图2(g)为氧化峰值电流(Ipa)和降低的峰值电流(Ipc)与扫描速率的平方根(v1/2)的线性拟合图。图3为本专利技术实施例1中的制备的探针的特异性和灵敏度分析图；其中，图3(a)用标准抗体和E-cad-抗体-QD探针孵育不同浓度细胞的E-钙粘蛋白的Western印迹图；图3(b)为来自不同浓度细胞的荧光强度曲线图；图3(c)为通过E-cad-抗体-QD探针，具有HNO3溶液的E-cad-抗体-QD探针和纯QD(比例尺，25μm)染色的细胞的免疫荧光显微镜检查图；图3(d)使用差分脉冲伏安法测量制备的电化学生物传感器的响应电流图，使用和不使用细胞传感器测量；图3(e)为优化E-cad-QD探针从0分钟到180分钟的孵育时间图。图4为本专利技术实施例1中使用EMT生物传感器对蛋白质水平和不同细胞浓度进行电化学检测图；其中，图4(a)为差异脉冲伏安法检测不同浓度的E-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针。


2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极，其制备方法为：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。


3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述E-cad-抗体-QD探针，其制备方法包括：向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行缀合反应，经纯化后即得。


4.权利要求1-3任一项所述用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备；和，
E-cad-抗体-QD探针的制备。


5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备方法包括：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极；
优选的，所述电极为预处理后的玻碳电极；
优选的，所述预处理方法为：使用氧化铝粉末(氧化铝粉末直径依次为0.3μm和0.05μm)抛光玻碳电极GCE的表面以除去氧化物层；同时为了除去其他物理吸附的物质，使用双蒸水和乙醇超声清洗电极表面；然后立即在氮气下干燥玻碳电极GCE；
优选的，所述改性剂中羧基化碳纳米管与HAuCl4的质量摩尔比为2～4mg:8～12mmol(优选为3mg:10mmol)；
优选的，所述羧基化碳纳米管悬浮液制备方法为：将CNT超声分散在0.4％聚二...

【专利技术属性】
技术研发人员：周军，杜欣，郑晓迪，张振华，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37