一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法技术

本发明专利技术涉及细胞分离领域，公开了一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法。该方法包括以下步骤：准备12周以上的成年小鼠，灌流得到体内消化后的肝脏，经加双抗的DMEM多次清洗后，进行肝脏的捣碎，捣碎后的肝脏经胶原酶和链霉蛋白酶混合液，37℃水浴锅中消化10分钟后，过200目滤网，经离心，去上清，密度梯度离心后，用肝星状细胞培养基置于5％CO

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法
本专利技术涉及细胞分离领域，具体是涉及一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法。
技术介绍
肝脏疾病已经成为影响中国国民健康不可忽视的疾病之一。肝纤维化是各种慢性肝脏疾病共有的病理结果，因此，如何逆转肝脏纤维化成为治疗各种慢性肝病的关键点。肝星状细胞是肝脏内占比较少的一类非实质细胞(约占肝细胞总数的8％-13％)，作为肝脏合成细胞外基质的主要细胞群，其不仅能分泌糖蛋白和蛋白多糖等细胞外基质成分，又能合成一定量的胶原酶以维持正常的基底膜结构，还能通过其突起的收缩参与肝窦的微循环调节。肝脏的损伤将会导致肝星状细胞的激活、增殖及转化，因此，对于肝星状细胞的研究将会是探究肝纤维化治疗的重要一环，对肝病的生存率及发生率有着不可估量的巨大意义。目前，人们对于肝星状细胞的认识主要集中于肝星状细胞的激活、增殖和胶原合成等方面。关于肝星状细胞在肝纤维化中的损伤修复以及其局部免疫特性还有待充分了解及深入研究，这需要建立一整套合适的肝星状细胞分离体系及细胞培养体系。然而，如何较高得率的从小鼠体内获取肝星状细胞依旧是个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液及胶原酶溶液，用手术剪刀剪下消化完全的肝脏；/n(2)将步骤(1)中获取的肝脏在DMEM中漂洗，剥碎，放入链霉蛋白酶与胶原酶组成的混合液中体外37℃消化10分钟，过200目细胞塞收集滤液；/n(3)将步骤(2)中获得的滤液580g离心10分钟、弃上清后加入密度梯度离心液通过高速离心机1380g离心17分钟，弃上清加入GBSS/B溶液后重悬再次600g离心10分钟，将细胞沉淀接种于6孔板中，孔中加入2ml肝星状细胞培...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液及胶原酶溶液，用手术剪刀剪下消化完全的肝脏；
(2)将步骤(1)中获取的肝脏在DMEM中漂洗，剥碎，放入链霉蛋白酶与胶原酶组成的混合液中体外37℃消化10分钟，过200目细胞塞收集滤液；
(3)将步骤(2)中获得的滤液580g离心10分钟、弃上清后加入密度梯度离心液通过高速离心机1380g离心17分钟，弃上清加入GBSS/B溶液后重悬再次600g离心10分钟，将细胞沉淀接种于6孔板中，孔中加入2ml肝星状细胞培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；
(4)细胞接种3h后，肝星状细胞开始贴壁，接种24h，大部分细胞都已贴壁，换液去除未贴壁死细胞，此后每两天进行换液。


2.根据权利要求1所述的小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)小鼠肝脏的灌流及体内消化：将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液和胶原酶溶液，其中，在EGTA溶液灌入3～5mL，肝脏明显变成土黄色时，剪开下腔静脉，用镊子将肝脏从小鼠体内剥离，确保周围结缔组织全部剥离完全，将剥离的肝脏放入EGTA溶液中，准备进行体外消化；
(2)体外消化与密度梯度离心：将肝脏从EGTA溶液中取出，用DMEM清洗液进行清洗，用无菌镊子将肝脏轻轻敲碎，用巴氏管吹打残余的小块肝脏组织，直到肝脏几乎为液体或黏稠状后，装入链霉蛋白酶与胶原酶的混合液中放置于37℃水浴锅里消化，消化后的小鼠肝脏通过200目细胞塞，过滤到50mL的EP管中，580g离心10分钟，弃上清，仅保留10mL在管内，再加入120uL的DNA酶，最后用GBSS/B溶液补齐至50ml，并用5mL的枪头进行重悬，放入离心机中，580g离心10分钟，离心完成后，弃上清，仅留10mL在离心管内，加入120uLDNA酶，用1mL的枪头进行重悬，用GBSS/B溶液补至16mL，然后加入8mL的密度梯度离心液，随后用5mL的枪头进行重悬，将50mL离心管中的溶液平均分入两个15mL离心管，用1mL的枪在溶液最上方轻轻覆盖一层3mL的GBSS/B，1380g离心17分钟，离心结束后，在密度梯度离心液与GBSS/B溶液的交接层会出现一层薄的白色细胞层便是肝星状细胞；
(3)肝星状细胞的培养：将中间层细胞吸至15mL离心管中，加入GBSS/B定容至15mL，重悬后放入离心机中，600g离心10分钟，弃上清，加入1mL肝星状细胞培养基重悬后接于6孔板中一孔，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，接种后3小时可观察到出现贴壁的细胞，接种24h后大部分细胞都已贴壁，更换肝星状细胞培养基以去除为贴壁细胞及死细胞，每2天换一次；
(4)肝星状细胞的传代：一旦原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，即采用胰酶消化传代，去除培养基，用不含钙镁离子的PBS进行洗涤，加入1～2mL胰酶，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中孵育1分钟，加入2～4mL含体积浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，轻柔吹打，使贴壁细胞脱落成单细胞状态，离心弃上清，加入2mL肝星状细胞培养基，按1:2的比例传代，在每1mL的细胞悬液中加入1-2mL的肝星状细胞培养基，接种于六孔板中，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养。


3.根据权利要求1或2所述的小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述小鼠为12周以后成年偏肥胖的小鼠；优选地，所述结扎小鼠的上腔静脉是将小鼠用3.6％水合氯醛麻醉后，浸泡在酒精中5-10秒，随后将小鼠置于解刨板上，刨开小鼠表皮与黏膜后，用手术线将连接小鼠肝脏的上腔筋脉进行结扎；优选地，所述从门静脉先后...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳全文，顾皓铖，李婧嫄，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36