用于治疗糖尿病的胰腺细胞及其生成方法技术

本公开提供了用于治疗糖尿病的基于细胞的组合物、用于鉴定优先分化成内胚层细胞的细胞的方法、用于制备胰岛素产生胰腺细胞的方法以及用于治疗与胰岛素缺乏相关的疾病的相关方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗糖尿病的胰腺细胞及其生成方法相关申请本申请根据美国法典第35款第119(e)条要求2018年2月9日提交的美国临时申请62/628,470的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本公开总体上涉及细胞生物学、干细胞和细胞分化领域。更具体地，本公开提供了用于生成胰腺细胞的方法、用于基于细胞的疗法的鉴定细胞的方法以及用于治疗糖尿病的相关方法。
技术介绍
提供下面的讨论以帮助读者理解本公开，并且不允许描述或构成本公开的现有技术。糖尿病和胰岛素糖尿病(diabetesmellitus)(即糖尿病(diabetes))是一种其中身体产生或响应胰岛素激素的能力受损，导致碳水化合物的异常代谢以及血液和尿液中升高的葡萄糖水平的疾病。该疾病被细分为若干种亚型，可替代地被描述为1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、青年人中的成人发病型糖尿病(MODY)、潜伏性成人糖尿病(LADA)、脆性糖尿病、消瘦型糖尿病、1.5型糖尿病、2型糖尿病、3型糖尿病、肥胖相关的糖尿病、妊娠糖尿病以及本领域接受的其他命名法。通常，患有胰岛素依赖型糖尿病的受试者需要施用外源性胰岛素以充分地降低血糖。非胰岛素依赖型受试者可以通过药物干预充分地降低血糖，所述药物干预包含增强对胰岛素敏感性或葡萄糖排泄的药物种类。患有胰岛素依赖型糖尿病的受试者可能会受益于细胞替代疗法，其中将胰岛素产生细胞植入到受试者中，无论该疾病是否被标记为1型糖尿病、MODY、LADA、脆性糖尿病、消瘦型糖尿病、1.5型糖尿病、2型糖尿病、3型糖尿病、肥胖相关的糖尿病或其任意组合。I型糖尿病通常在儿童和青年人中诊断，并且以前被称为青少年糖尿病。只有5-10％的患有糖尿病的人具有这种形式的疾病。成人发病型糖尿病是该疾病最常见的形式，并且其是由于胰岛素产生β细胞的损伤或破坏、胰岛素抗性的发展或胰岛素产生β细胞的损伤和胰岛素抵抗的发展两者而产生的。由于遗传和环境因素的结合，糖尿病可以在非肥胖的成人和儿童中出现。在肥胖的成人和儿童中，胰腺可能试图制造附加胰岛素以便控制血糖，但随着时间的推移，其无法保持并维持血糖在正常水平。身体对产生的胰岛素也可能变得不太敏感。分泌胰岛素的β细胞的长期过度活动可能导致β细胞功能障碍和死亡。糖尿病的症状根据受试者的血糖波动多少而变化。一些人(尤其是那些患有前驱糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病的人)最初可能不会出现症状。在I型糖尿病中，症状倾向于很快出现，并且更加严重。I型糖尿病和II型糖尿病的一些体征和症状包含但不限于增加的口渴；尿频；极度饥饿；无法解释的体重减轻；在尿液中存在酮(酮是在没有足够的可用胰岛素时发生的肌肉和脂肪分解的副产物)；疲劳；易怒；模糊的视力；伤口愈合缓慢；频繁感染，诸如牙龈或皮肤感染和阴道感染。用于治疗糖尿病的基于细胞的疗法胰岛素依赖型糖尿病患者可以潜在地通过移植新的胰岛素产生细胞来治愈，但是这种方法迄今为止已经受到限制，因为这些细胞难以以足够的数量和质量获得。参见，例如PagliucaFW,etal.Cell,154(2):428-439(2014)。因此，长期以来，生物医学研究的目标是以更有效和更可预测的方式从人类干细胞中生成胰岛素产生β细胞。Id.为了实现这一目标，必须建立生成统一的β细胞群体的方案，该β细胞群体在暴露于葡萄糖时产生胰岛素。然而，这样的方案仍然难以达成。许多研究小组已经提出了各种方案，这些方案使用不同的细胞系产生了不同的结果。功能性β细胞的这种不一致的产生增加了获得治疗益处所需的总细胞剂量，因此增加了潜在疗法的成本，并且由于可变的结果而限制了临床适用性。从人类干细胞生成胰岛素产生β细胞的大多数既定方案产生高度可变的细胞群体。参见，例如PagliucaFW,etal.Cell,154(2):428-439(2014)。实际上，在本领域中，通常的做法是针对特定的细胞系调整给定的分化方案，从而阻止了本领域中分化的任何标准化。从各种分化方案中提高β细胞产量的方法通常包含以反复试错类型的方法测试影响分化途径的许多因素的组合。参见，例如PagliucaFW,etal.Cell,154(2):428-439(2014)；RezeniaA.etal.Nat.Biotech.,32:1121-33(2014)；SchulzTCetal.PlosOne,7:e37004(2012).ChettyS.etal.Nat.Methods,10:553-556(2012)。因此，用于从一个起始干细胞群体制备β细胞的特定方案可能对分化不同的起始群体是无效的。此外，所产生的分化的细胞群体中的不一致性已经影响了任何所提出的疗法的临床应用，因为该领域的研究人员一直在努力获得具有持续高百分比的胰岛素产生细胞的分化群体。这不仅降低了治疗糖尿病的基于细胞的疗法的潜在功效，而且还引起了对关于含有异源细胞群体的细胞移植的致瘤潜力的担忧。此外，细胞批次之间的低再现性直接影响产生细胞的成本，并且限制了该方案向临床的转化。在采用不同的分化方案中的这种可变性中的一些可以追溯到起始细胞系。例如，已经显示多能细胞系在分化成某些谱系的能力上可以有很大差异。参见BockCetal.Cell,144:439-452(2011)；LimHetal.J.Vis.Exp.,(90):e51755(2014)；OsafuneKetal.Nat.Biotechnol.,26:313-315(2008)。单个人类干细胞在其对目前使用的分化方案的反应中的这种不同能力已被证明是难以克服的障碍，因为研究人员没有迹象表明给定的细胞系或起始细胞最终产生治疗性细胞的潜力。此外，当使用具有稍微不同遗传背景的细胞系时，由现有技术提供的指导实际上可能适得其反。例如，从多能干细胞生成胰岛素产生细胞的既定方案的一致特征是限制暴露于视黄酸和环巴胺。参见Nostroetal.StemCellReports,4:1-14(2015)。来自现有技术的另一个一致的指导是，为了胰腺细胞的适当成熟，需要在悬浮的三维培养物中开始分化。参见PagliucaFW,etal.Cell,154(2):428-439(2014),Rezaniaetal.NatureBiotechnology,32(11):1121-33(2014)。如下面更详细地讨论的，遵循这样的指导实际上可以抑制胰岛素分泌细胞从各种干细胞系的分化。因此，仍然需要生成用于治疗糖尿病的治疗性的胰岛素产生细胞的改进的和可预测的方法。本公开满足了这些需求。
技术实现思路
本文描述了产生胰岛素并且可以用于治疗糖尿病的细胞和细胞组合物，以及其制备和鉴定方法。在一个方面，本公开提供了产生哺乳动物胰岛素分泌细胞的方法，其包括：粘附培养哺乳动物干细胞，从而使哺乳动物干细胞自发地形成三维结构；和悬浮培养所述三维结构；其中培养步骤包括至少20天暴露于视黄酸和环巴胺，并且不包括将三维结构的干细胞暴露于Wnt3A。在另一个方面，本公开提供了产生胰岛素分泌细胞的方法，其包括：在包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生哺乳动物胰岛素分泌细胞的方法，其包括：/na.粘附培养哺乳动物干细胞，从而使所述哺乳动物干细胞自发地形成三维结构；和/nb.悬浮培养所述三维结构；/n其中培养步骤包括至少20天暴露于视黄酸和环巴胺，并且不包括将三维结构的所述干细胞暴露于Wnt3A。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180209 US 62/628,4701.一种产生哺乳动物胰岛素分泌细胞的方法，其包括：
a.粘附培养哺乳动物干细胞，从而使所述哺乳动物干细胞自发地形成三维结构；和
b.悬浮培养所述三维结构；
其中培养步骤包括至少20天暴露于视黄酸和环巴胺，并且不包括将三维结构的所述干细胞暴露于Wnt3A。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是人类干细胞。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是非人灵长类干细胞。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞来源于细胞系。


5.一种产生胰岛素分泌细胞的方法，其包括：
a.在包括激活素-A和渥曼青霉素的第一培养基中，在粘性基底上培养哺乳动物干细胞，其中所述哺乳动物干细胞不暴露于Wnt3a；
b.在包括视黄酸和环巴胺的至少一种附加培养基中进一步培养所述细胞；和
c.当所述细胞形成三维细胞结构时，将所述细胞转移到悬浮培养物中；
其中所述细胞暴露于视黄酸和环巴胺至少20天。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞在所述粘性基底上培养时形成三维结构。


7.根据权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是人类干细胞。


8.根据权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是非人灵长类干细胞。


9.一种产生哺乳动物胰岛素分泌细胞的方法，其包括：
a.在包括内胚层诱导因子的第一培养基中培养哺乳动物干细胞，从而将所述哺乳动物干细胞分化为内胚层细胞；和
b.在包括内分泌诱导因子的第二培养基中培养来自(a)的所述内胚层细胞，从而将所述内胚层细胞分化为内分泌细胞；
其中所述哺乳动物干细胞在分化成内胚层细胞之前没有暴露于角质细胞生长因子(KGF)。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是人类干细胞。


11.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是非人灵长类干细胞。


12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述内胚层诱导因子包括激活素-A。


13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包括渥曼青霉素。


14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述第一培养基不包括Wnt3A。


15.根据权利要求9-14中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述第一培养基中培养1-3天。


16.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述内分泌诱导因子包括视黄酸和环巴胺。


17.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包括noggin。


18.根据权利要求9-17中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包括KGF。


19.根据权利要求9-18中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述第二培养基中培养1-4天。


20.根据权利要求9-19中任一项所述的方法，进一步包括在包括KGF的第三培养基中培养所述内分泌细胞，从而将所述内分泌细胞分化为胰腺祖细胞。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第三培养基包括noggin和表皮生长因子(EGF)。


22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述第三培养基包括视黄酸和环巴胺。


23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述第三培养基中培养1-4天。


24.根据权利要求20所述的方法，进一步包括在包括noggin、EGF、γ-分泌酶抑制剂XXI和Alk5iII的第四培养基中培养所述胰腺祖细胞。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第四培养基包括视黄酸和环巴胺。


26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述细胞在所述第四培养基中培养1-4天。


27.根据权利要求24所述的方法，进一步包括在包括Alk5iII和视黄酸的第五培养基中培养所述胰腺祖细胞。


28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第五培养基包括环巴胺。


29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述细胞在所述第五培养基中培养1-5天。


30.根据权利要求27所述的方法，进一步包括在包括Alk5iII、烟酰胺和胰岛素样生长因子(IGF)-I的第六培养基中培养所述胰腺祖细胞。


31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第六培养基包括视黄酸和环巴胺。


32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述细胞在所述第六培养基中培养1-9天。


33.根据权利要求9-32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞来源于胰腺原代组织。


34.根据权利要求9-32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是人类胚胎干细胞。


35.根据权利要求9-32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是诱导的多能干细胞。


36.根据权利要求9-32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是非多能重编程细胞。


37.根据权利要求36所述的方法，其中所述重编程细胞来源于胰腺原代组织。


38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中通过表达重编程基因而不将所述重编程基因掺入到所述细胞的基因组中来重编程所述重编程细胞。


39.根据权利要求38所述的方法，其中所述重编程基因编码在至少一个附加体表达质粒上。


40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述重编程基因包括O...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·L·鲁斯特，
申请(专利权)人：塞拉克西斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US