从海藻生产葡萄糖及昆布多糖寡糖的新型β-葡萄糖苷酶制造技术

本发明专利技术涉及一种用于从海藻生产葡萄糖及昆布多糖寡糖的新型β‑葡萄糖苷酶。更具体来说，本发明专利技术可从表现出转糖苷酶活性同时表现出针对β‑葡聚糖的外切型葡聚糖酶活性的β‑葡萄糖苷酶生产葡萄糖，且通过在不同的反应条件下表现出针对昆布多糖的转糖苷酶活性来生产昆布多糖寡糖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从海藻生产葡萄糖及昆布多糖寡糖的新型β-葡萄糖苷酶
本专利技术涉及一种用于从海藻生产葡萄糖及昆布寡糖的新型β-葡萄糖苷酶。
技术介绍
随着人们对全球变暖的关注，人们对用于可持续发展的可再生生物质的兴趣不断增加。木质纤维素生物质由于丰富的资源及低廉的成本，长期以来被认为是用于生产可发酵糖(例如葡萄糖)的可再生生物质。然而，其具有高含量的木质素及非常复杂的结构，且因此需要高强度的预处理及酶促糖基化，从而使其难以使用。近来，海藻作为替代木质纤维素生物质的生物质受到广泛关注，且在高碳水化合物含量、不需要耕地以及由于几乎没有木质素含量而具有简单结构方面是有利的。在海洋藻类中，全世界每年收获约70百万吨褐藻，褐藻的主要碳水化合物成分是海藻酸及葡聚糖，且葡聚糖主要是昆布多糖。昆布多糖在其骨架中具有β-1,3键，且在其分支中具有β-1,6键。在褐藻中，昆布属(Laminarina)、海带属(Saccharina)及岩藻属(Fucusspp.)具有30％到80％干重的高昆布多糖含量。由于昆布多糖是由葡萄糖组成的多糖，因此昆布多糖是用于生产可发酵糖的非常理想的生物质。此外，已知从昆布多糖生产的昆布寡糖具有多种生理活性，且因此可用作功能材料。为使用木质纤维素生物质生产可发酵糖，需要高强度的预处理，且其需要至少三种酶的组合，例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-糖苷酶。这种预处理工艺使用高热量，且因此需要大量能量，并且在酶促糖基化工艺中使用的酶的成本占整个生物工艺的很大一部分。因此，需要一种通过使用最少数量的酶以降低的生产成本高效地水解昆布多糖来生产作为发酵糖的葡萄糖及作为功能材料的昆布寡糖的工艺。
技术实现思路
技术挑战本专利技术的目的是提供用于从褐藻生产葡萄糖及昆布寡糖的新型β-葡萄糖苷酶的用途。技术解决方案根据本公开的方面，提供一种用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列SEQIDNO:1的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，其中所述β-葡萄糖苷酶具有外切型葡聚糖酶活性及转糖苷酶活性。本专利技术还提供一种生产葡萄糖或昆布寡糖的方法，所述方法包括使具有氨基酸序列SEQIDNO:1的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)与昆布多糖或昆布二糖反应，从而生产葡萄糖或昆布寡糖。本专利技术的效果本专利技术的β-葡萄糖苷酶对作为多糖的昆布多糖表现出外切型葡聚糖酶活性，且因此仅生产葡萄糖，并且还通过改变反应条件表现出对昆布多糖或昆布二糖的转糖苷酶活性，且因此具有生产葡萄糖和/或昆布寡糖的效果。附图说明图1是确认本专利技术的β-葡萄糖苷酶的表达的凝胶图像。图2示出确认本专利技术的β-葡萄糖苷酶的最佳活性pH的结果。图3示出确认本专利技术的β-葡萄糖苷酶的最佳温度的结果。图4示出确认本专利技术的β-葡萄糖苷酶的热稳定性的结果。图5示出通过使用各种二糖作为基质筛选β-葡萄糖苷酶的基质特异性而获得的薄层色谱(TLC)分析结果，其中(a)示出陆地来源的二糖，且(b)示出海洋来源的二糖。图6a示出通过水解昆布多糖生产的作为主要产物的葡萄糖的产率，且图6b示出主要产物的高效液相色谱(HPLC)分析结果。图7a示出通过针对昆布多糖的转糖苷酶活性生产的昆布寡糖的HPLC分析结果，且图7b示出昆布寡糖的TLC分析结果。图8a示出通过针对昆布二糖的转糖苷酶活性生产的昆布三糖及葡萄糖的HPLC分析结果，图8b示出昆布三糖及葡萄糖的TLC分析结果，且图8c示出Bgl1B的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。具体实施方式本专利技术的专利技术人检查了Bgl1B蛋白的昆布多糖降解活性，所述Bgl1B蛋白假设具有β-葡萄糖苷酶活性。结果，通过使用作为由β-1,3连接的骨架及β-1,6-连接的分支构成的葡萄糖多糖的昆布多糖作为基质，确认了Bgl1B蛋白通过外切型葡聚糖酶活性将昆布多糖的β-1,3-或β-1,6-糖苷键裂开，从而仅生产葡萄糖。还确认了Bgl1B蛋白具有转糖苷酶活性，且因此通过控制酶的浓度及反应时间，从昆布多糖或昆布二糖生产具有高聚合度的寡糖。因此，本专利技术提供一种用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列SEQIDNO:1的β-葡萄糖苷酶，其中所述β-葡萄糖苷酶具有外切型葡聚糖酶活性及转糖苷酶活性。本专利技术还提供一种生产葡萄糖或昆布寡糖的方法，所述方法包括使具有氨基酸序列SEQIDNO:1的β-葡萄糖苷酶与昆布多糖或昆布二糖反应，从而生产葡萄糖或昆布寡糖。β-葡萄糖苷酶不仅表现出能使昆布多糖的β-1,3-或β-1,6-糖苷键裂开的外切型葡聚糖酶活性，而且还针对昆布多糖或昆布二糖表现出转糖苷酶活性。此外，缓冲液中的β-葡萄糖苷酶的最佳pH可根据缓冲液的类型而变化，但β-葡萄糖苷酶在约pH5到约pH7.5时表现出80％或大于80％的酶活性，且特别是在pH为6时表现出最高活性。此外，β-葡萄糖苷酶在pH为6及10℃到40℃下表现出80％或大于80％的酶活性。然而，在50℃或高于50℃下，酶活性急剧降低，且因此，由于β-葡萄糖苷酶即使在室温下也可引起充分的酶促反应，因此存在的优点是生产工艺可经济地执行，而不需要升高温度的能量消耗。此外，与现有的酶不同，即使在相对低的温度下进行热处理，酶也可能失活。此外，作为检查金属离子对β-葡萄糖苷酶的酶活性的影响的结果，Mg2+、Ni2+及Co2+对酶活性没有很大影响，而Mn2+抑制酶活性约50％，且Cu2+及Fe2+强烈抑制酶活性约10％或小于10％。β-葡萄糖苷酶可来源于变形菌株2-40T(Saccharophagusdegradans2-40T)，但本专利技术不特别受限于此。此外，β-葡萄糖苷酶可从与多肽生产相关联的DNA片段(即编码基因)转录及转译，所述多肽不仅包括酶编码区的上游及下游的区，而且还包括各个编码片段之间的内含子。举例来说，β-葡萄糖苷酶可从以SEQIDNO：2阐述的序列来转录及转译，但本专利技术不受特别限制。此外，具有葡萄糖或昆布寡糖水解活性的蛋白，作为来源于具有一个或多个取代、缺失、易位、添加等的酶的突变蛋白，也落在本专利技术的酶的范围内，且所述蛋白优选地包括与以SEQIDNO:1阐述的氨基酸序列具有至少80％的同源性、至少85％的同源性、至少90％的同源性、至少93％的同源性、至少94％的同源性、至少95％的同源性、至少96％的同源性、至少97％的同源性、至少98％的同源性及至少99％的同源性的氨基酸序列。β-葡萄糖苷酶可从变形菌株2-40T培养物的上清液中分离及纯化，或者可通过使用除变形菌株2-40T以外的菌株，通过基因工程重组技术，或通过人工化学合成方法等来生产及分离。当使用重组技术时，可使用用于促进传统重组蛋白表达的因子，例如抗生素抗性基因及可用于亲和性柱色谱法中的报告蛋白或肽，且此种技术落在本专利技术所属领域的一般技术人员可容易实施的范围内。例如，β-葡萄糖苷酶可从用包含对β-葡萄糖苷酶进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，所述组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶，其中所述β-葡萄糖苷酶具有外切型葡聚糖酶活性及转糖苷酶活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180312 KR 10-2018-00285101.一种用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，所述组合物包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶，其中所述β-葡萄糖苷酶具有外切型葡聚糖酶活性及转糖苷酶活性。


2.根据权利要求1所述的用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，其中所述β-葡萄糖苷酶来源于变形菌株2-40T。


3.根据权利要求1所述的用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，其中所述β-葡萄糖苷酶是从用重组载体转化的宿主细胞或所述宿主细胞的培养物获得，所述重组载体包含编码所述β-葡萄糖苷酶进行的基因。


4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述基因具有SEQIDNO:2的核苷酸序列。


5.根据权利要求1所述的用于生产葡萄糖或昆布寡糖的组合物，其中所述β-葡萄糖苷酶使用选自由昆布多糖、昆布二糖、纤维二糖、龙胆二糖、乳糖及琼脂二糖组成的群组中的任一种基质。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，金东玄，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR