miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用制造技术

本发明专利技术公开了miR‑1468‑5p在评估宫颈癌患者PD‑L1表达中应用，本发明专利技术首次发现了miR‑1468‑5p的表达水平与PD‑L1表达呈正相关，因此可以通过CCa患者miR‑1468‑5p的表达水平对PD‑L1表达进行评估；由于miR‑1468‑5p的表达水平可通过血浆外泌体进行检测，因此可以通过检测血浆外泌体中miR‑1468‑5p的表达水平即可实现PD‑L1表达水平的评估，实时性、灵敏性更强，且更方便；本发明专利技术还进一步提供了通过血浆外泌体中miR‑1468‑5p的表达水平对PD‑L1进行评估具体的方法，拓阔了PD‑L1检测渠道，且检测更准确，重复性好，对于宫颈癌临床预后评估具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用。
技术介绍
PD-L1也称为B7-H1或CD274，通过与程序性死亡1(PD-1)受体结合而促进T细胞功能障碍。作为主要的免疫检查点，PD-L1在塑造免疫抑制性肿瘤微环境中起着关键作用。多数肿瘤高表达PD-L1蛋白，与其不良预后密切相关。目前检测PD-L1的方式主要是免疫组化法，但是存在以下问题：1.采用“免疫组化法”直观检测肿瘤组织中PD-L1蛋白表达，但不能实现实时检测；2.免疫组化抗体多样性，评估层次不均一。因此，如何高效准确的判断肿瘤组织PD-L1表达量对评估患者临床预后至关重要。液态活检是指以非侵入方式从体液中获得生物标记物并对其分析，从而反映其来源组织的相关信息的检测技术。随着社会的进步和医学技术的不断发展，对于恶性肿瘤精准诊治的要求不断提高。随着对肿瘤分子机制逐渐深入地研究，使得液态活检所涉及的研究内容从传统的肿瘤循环细胞(circulatingtumorcell,CTC)和肿瘤循环DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)发展至肿瘤细胞来源的外泌体。肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)富含肿瘤细胞特征性物质，尤其是miRNAs，并普遍存在于患者体液中，其能够将这些遗传信息或肿瘤信号通路转移至肿瘤微环境中，促进肿瘤转移，在应用于肿瘤的早期筛查和临床诊断中有显著优势。因此，开发一种能够通过液态活检对PD-L1表达进行评估的方法具有重要的意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种通过对宫颈癌(CCa)患者血浆外泌体miR-1468-5p表达水平的检测实时评估PD-L1表达，从而有效评估宫颈癌临床预后的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用。本专利技术还要求保护miR-1468-5pPCR引物在制备PD-L1表达诊断试剂或试剂盒中的应用。具体地，通过miR-1468-5pPCR引物检测宫颈癌患者样品中miR-1468-5p的表达，从而评估PD-L1表达。作为本专利技术的优选实施方式，所述宫颈癌患者样品为血样。本专利技术还要求保护miR-1468-5pPCR引物在制备宫颈癌临床预后诊断试剂或试剂盒中的应用。具体地，通过miR-1468-5pPCR引物检测宫颈癌患者样品中miR-1468-5p的表达，从而评估PD-L1表达，进而实现宫颈癌临床预后的评估。作为本专利技术的优选实施方式，所述宫颈癌患者样品为宫颈癌患者血样。本专利技术还提供了一种通过血浆评估PD-L1表达的方法，包括如下步骤：(1)、提取血浆外泌体；(2)、通过miR-1468-5pPCR引物检测miR-1468-5p的表达量；(3)、若miR-1468-5p的相对表达量≥1.793，说明PD-L1高表达，否则PD-L1低表达。相对于组织切片，血浆的获取更容易，优选通过提取血浆中的外泌体，检测其中miR-1468-5p的含量，从而对PD-L1的表达进行评估。相比于血浆外泌体miR-1468-5p低表达组，高表达组的临床预后更差。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤(1)中血浆外泌体的提取的具体过程为：(1a)、收集宫颈癌患者血浆的全血样本，离心获取血浆；(1b)、离心步骤(1a)所述血浆，去除残余血细胞；(1c)、离心步骤(1b)去除残余血细胞后的血样，去除细胞碎片；(1d)、将步骤(1c)获得的混合物与PBS等比例稀释，离心得到所述血浆外泌体。更优选地，所述血浆外泌体的制备方法如下：(1)、收集2mLCCa患者全血样本，4℃，3000g，离心30分钟，获取约1mL的血浆；(2)、4℃，8000g，离心30分钟，去除残余血细胞；(3)、4℃，12000g，离心30分钟，去除细胞碎片；(4)、将离心去除血细胞和细胞碎片后的血浆用等体积的PBS稀释，4℃，160000g，离心16小时，富集得到所述血浆外泌体。本专利技术还要求保护用于评估宫颈癌患者PD-L1表达或宫颈癌临床预后的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括miR-1468-5pPCR引物。作为本专利技术的优选实施方式，所述miR-1468-5pPCR引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物。更优选地，还包括和引物mRQ3’。核苷酸序列如SEQIDNO.1(CTCCGTTTGCCTGTTTCGCTG)所示的引物为正向引物；引物mRQ3’为反向引物，为TaKaRa公司的Mir-XTMmiRNAFirst-StandSynthesisandSYBRRqRT-PCR试剂盒内含的组分。其检测的PCR扩增程序为：(1)预变性：95℃30s；(2)扩增：95℃5s，60℃34s，共40个循环。作为本专利技术的优选实施方式，所述包括miR-1468-5p的PCR引物的检测试剂盒还包括内参基因的引物。更优选地，所述内参基因为U6。作为本专利技术的优选实施方式，所述检测miR-1468-5p表达量的检测试剂为miR-1468-5pPCR引物。本专利技术首次发现了miR-1468-5p的表达水平与PD-L1表达呈正相关，因此可以通过CCa患者miR-1468-5p的表达水平对PD-L1表达进行评估；由于miR-1468-5p的表达水平可通过血浆外泌体进行检测，因此可以通过检测血浆外泌体中miR-1468-5p的表达水平即可实现PD-L1表达水平的评估，实时性、灵敏性更强，且更方便；本专利技术还进一步提供了通过血浆外泌体中miR-1468-5p的表达水平对PD-L1进行评估具体的方法，拓阔了PD-L1检测渠道，且检测更准确，重复性好，对于宫颈癌临床预后评估具有重要的意义。附图说明图1为hCEp和Siha细胞外泌体的提取和鉴定；A为细胞外泌体的提取和鉴定流程图，B为通过透射电子显微镜观察外泌体的形态，C为通过WB对外泌体特异标记物进行检测的检测结果。图2为hCEp和Siha细胞外泌体中RNA的分析结果；A为外泌体RNA表达热图，B为瞬转RNA至hCEp细胞对PD-L1表达的影响结果，C为不同宫颈癌系外泌体中miRNAs的表达情况。图3为血浆外泌体的提取和鉴定；A为血浆外泌体的提取和鉴定流程图，B为通过透射电子显微镜观察外泌体的形态，C为通过WB对外泌体特异标记物进行检测的检测结果。图4为血浆外泌体miR-1468-5p与PD-L1的相关性分析结果；A为不同类型样本血浆外泌体miR-1468-5p的相对表达量，B为不同类型样本血浆外泌体miR-1468-5p的相对表达量，***，P＜0.001，C为通过spearman相关性分析对血浆外泌体中miR-1468-5p的相对表达量与PD-L1的相关性分析结果，D为通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用。/n

【技术特征摘要】
1.miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用。


2.miR-1468-5pPCR引物在制备PD-L1表达诊断试剂或试剂盒中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过miR-1468-5pPCR引物检测宫颈癌患者样品中miR-1468-5p的表达，从而评估PD-L1表达。


4.miR-1468-5pPCR引物在制备宫颈癌临床预后诊断试剂或试剂盒中的应用。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，通过miR-1468-5pPCR引物检测宫颈癌患者样品中miR-1468-5p的表达，从而评估PD-L1表达，进而实现宫颈癌临床预后的评估。


6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌患者样品为宫颈癌患者血样。


7.一种通过血浆评估PD-L1表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、提取血浆...

【专利技术属性】
技术研发人员：王薇，周琛斐，吴砂，魏文斐，吴湘光，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：广东;44