I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了I型普鲁兰酶的突变体酶，突变体酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了编码所述突变体酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还公开了突变体酶的制备方法，包括根据I型普鲁兰酶的氨基酸序列进行同源建模，基于序列比对分析和蛋白结构分析，选取突变位点并设计对突变引物对；以携带I型普鲁兰酶基因的载体为模板，分别进行定点突变反应，得到突变质粒；于突变质粒转化工程菌中复制表达对应的突变体酶。本发明专利技术的突变体酶具有更优的耐热性能和比酶活。

【技术实现步骤摘要】
I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程和酶工程
更具体地说，本专利技术涉及一种I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用。
技术介绍
目前已经有很多普鲁兰酶被挖掘出来，甚至普鲁兰酶已经在基因层面进行了研究。但是真正能应用于工业生产中的却很少，目前商业化程度最高的是来源于Bacillusacidopullulyticus的普鲁兰酶。普鲁兰酶最主要的应用方式是用于淀粉的糖化过程，其工业应用条件为pH4.5～5.5，温度55～65℃甚至更高，持续作用时间长达48～60h(NISHAandSATYANARAYANA,2016)。大多数已报道的I型普鲁兰酶均无法适应这一工业条件，有些酶耐热性差，有些酶在pH5.5或更低的条件下酶活很低，甚至会失活。即使是商业化的B.acidopullulyticus普鲁兰酶也存在明显短板，其在60℃时的半衰期仅有34.9min，没有足够强的耐热性。针对以上现状，本专利技术以普鲁兰酶的耐热性作为首要考虑因素，拟挖掘具有较强耐热性的普鲁兰酶。耐热普鲁兰酶的微生物来源多是嗜热或极端嗜热微生物，其生长条件恶劣，培养条件苛刻，不利于取样和筛选。因此，采用基因工程技术方式得到耐热性好的普鲁兰酶是值得尝试的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶，以及耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶的制备方法，得到的突变体酶具有优良的耐热性能以及优良的比酶活。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种I型普鲁兰酶的突变体酶，所述突变体酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。提供一种编码所述突变体酶的基因，编码所述突变体酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。提供一种包含编码上述突变体酶的基因的工程菌。提供一种包含编码上述的突变体酶的基因的载体。提供一种制备所述突变体酶的方法，包括以下步骤：步骤一、根据NCBI数据库中公开的I型普鲁兰酶的氨基酸序列，进行同源建模，基于序列比对分析和蛋白结构分析，选取距离I型普鲁兰酶的催化位点10埃以内的氨基酸残基作为对象，通过序列比对排除掉其中非常保守的氨基酸残基，选取1个非保守氨基酸突变位点，对该突变位点设计对应的突变引物对，所述突变引物对为5′-CGTATCTGAATGAAAGCGGCTGCGGCAATGTTATG-3′和5′-GCAGCCGCTTTCATTCAGATACGCGCCGGTTTTATC-3′；步骤二、以携带I型普鲁兰酶基因的载体为模板，使用设计的突变引物对，利用PCR突变方法，进行点突变反应，得到带有突变体酶基因的突变质粒；步骤三、将步骤二中得到的突变质粒转化为可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达对应的突变体酶。优选的是，步骤二中的点突变反应条件为：94℃预变性5min；94℃解链20s，65℃退火20s，72℃延伸4min，共25个循环；72℃延伸10min；4℃保温。优选的是，步骤二中的工程菌为大肠杆菌。优选的是，步骤二中的载体为pET-22b(+)。优选的是，还包括采用Ni2+亲和层析的方式对突变体酶进行分离纯化。提供一种上述突变体酶在制备酶解含有a-1，6糖苷键的多糖的产品中的应用。本专利技术至少包括以下有益效果：第一、得到了一种耐热性能和比酶活均优于现有的I型普鲁兰酶的突变体酶。第二、相比于现有的普鲁兰酶PulF，突变体酶在比较宽的pH范围内具有较高的酶活，尤其是在pH5.0～5.5的范围内，突变体酶的相对酶活均大于85％。在pH6.0～7.0范围内，突变体酶的相对酶活都明显高于普鲁兰酶PulF。第三、普鲁兰酶PulF和突变体酶V481C的相对酶活变化趋势较为相似，当pH远离最适值时两个酶的酶活都迅速降低。且不同缓冲体系对两个酶的影响都很大，在pH6.0的磷酸盐缓冲液中的相对酶活是在pH6.0醋酸缓冲液中的将近3倍。所以结合这一工业应用条件分析，突变体酶相比于普鲁兰酶PulF来说最大的优点是：在pH5.0～5.5范围内均具有较高酶活，对糖化过程中反应液的pH环境要求不苛刻。第四、当普鲁兰酶PulF突变为V481C后，最适温度没有变化，仍为80℃。此外，通过比较普鲁兰酶PulF和突变体酶随温度变化而产生的相对酶活变化的趋势，可以看出，突变体酶V481C的相对酶活变化趋势和普鲁兰酶PulF几乎一致。制糖工业中普鲁兰酶反应的温度范围为55～65℃甚至是更高的温度，其中最常用的反应温度为60℃，所以结合这一工业应用条件分析，突变体酶的优势在于其在温度60℃～75℃范围内具有更高的相对酶活。第五、在75℃和80℃条件下，突变体酶的热稳定性均有所增强。75℃条件下，V481C的半衰期最长，比普鲁兰酶PulF在同条件下的半衰期提高了近13倍。80℃条件下，所有酶的半衰期都很短。第六、相比于普鲁兰酶PulF而言，突变体酶的Km值有所降低，说明突变体酶与普鲁兰多糖的结合能力增强了；突变体酶V481C的催化常数Kcat/Km有所增加，说明突变体酶对普鲁兰多糖的催化效率提高了。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的点突变PCR产物的核酸电泳图；图2为本专利技术的蛋白标准曲线；图3为本专利技术的纯化后的突变体酶的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图4为本专利技术的突变体酶和普鲁兰酶PulF的75℃条件下的半衰期图；图5为本专利技术的突变体酶的80℃条件下的半衰期图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。1、原料准备生物材料：如表1所示表1生物材料pET-22b(+)-pulF的构建方法：选取登录号和微生物来源为WP_011994577.1(FervidobacteriumnodosumRt17-B1)为原始酶，为方便表述，将这个普鲁兰酶命名为PulF。普鲁兰酶PulF的基因序列去除信号肽编码序列后，来源于Fervidobacteriumnodosum的基因片段全长为2460bp，对2460全长片段的基因进行密码子优化后，由华大基因进行合成。合成的基因序列均通过NdeI/XhoI双酶切位点连接到表达载体pET-22b(+)中，并转入感受态细胞BL21(DE3)。从添加了氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB平板中挑取阳性克隆，测序成功的重组菌保存在15％甘油管中。构建成功的重组质粒命名为pET-22b(+)-pulF。其中，编码普鲁兰酶PulF的核苷酸序列如SEQIDNo.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.I型普鲁兰酶的突变体酶，其特征在于，所述突变体酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.I型普鲁兰酶的突变体酶，其特征在于，所述突变体酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.编码权利要求1所述的突变体酶的基因，其特征在于，编码所述突变体酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.包含编码权利要求1所述的突变体酶的基因的工程菌。


4.包含编码权利要求1所述的突变体酶的基因的载体。


5.制备如权利要求1所述的突变体酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、根据NCBI数据库中公开的I型普鲁兰酶的氨基酸序列，进行同源建模，基于序列比对分析和蛋白结构分析，选取距离I型普鲁兰酶的催化位点10埃以内的氨基酸残基作为对象，通过序列比对排除掉其中非常保守的氨基酸残基，选取1个非保守氨基酸突变位点，对该突变位点设计对应的突变引物对，所述突变引物对为5′-CGTATCTGAATGAAAGCGGCTGCGGCAATGTTATG-3′和5′-GCAGCCGCTTTCATTCAGATACGCGCCGGTTTTATC-3′；
步...

【专利技术属性】
技术研发人员：逄晓阳，吕加平，杨洋，芦晶，张书文，李伟勋，朱青，徐琛，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11