一种ω-转氨酶突变体、基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ω‑转氨酶突变体、基因及应用。野生型ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ω‑转氨酶突变体为以下一种：(1)L118T/F115L双突变的突变体；(2)L118T/F115L/E133A三突变的突变体；(3)L118T/F115L/E133K三突变的突变体；(4)L118T/F115L/E253A三突变的突变体。本发明专利技术基于技术成熟的遗传算法，以及TK‑SA模型算法，在此基础上改进得到ETSS算法，结合ω‑转氨酶表面电荷‑电荷相互作用，确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证，该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性、酶活性明显优于野生酶的突变酶。

【技术实现步骤摘要】
一种ω-转氨酶突变体、基因及应用
本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种ω-转氨酶突变体、基因及应用。
技术介绍
手性胺是手性药物的重要组成部分，是一类极其重要的精细化工和医药中间体。随着手性药物市场的不断扩大，手性胺的需求迅速增长。对手性胺类药物进行更加深层次的研究具有较大的商业经济效益和工业应用价值。目前，超过70％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体。转氨酶是催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的一类酶，可以通过简单的催化剂里，可逆地将来源于氨基酸供体的氨基转移到氨基酸受体上。目前，在不对称合成手性胺类化合物及胺类化合物外消旋体拆分中，转氨酶都是关键的生物技术酶。由于其不对称催化合成手性胺的特点，转氨酶已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。来自于土曲霉属(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)的参与，催化过程如下所示：实验表明，ω-转氨酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，不利于应用到工业生产中，其热稳定性有待进一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。转氨酶在合成手性胺方面具有较好的应用前景，但由于野生型酶在底物特异性、稳定性、催化效率等方面存在诸多不足，目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限。基于非理性、理性及半理性设计策略的蛋白质工程技术能有效改善转氨酶的应用性能，为手性胺的高效制备提供了可能。随着转氨酶蛋白结构和催化机制相关研究的深入，利用理性或半理性设计策略对转氨酶进行分子改造的研究备受关注。在自然进化的过程中，大多数的蛋白质的表面氨基酸残基具有较大的不保守性，对酶的催化性能和热稳定性有重要的微调作用。蛋白质表面带点残基的等电点(isoelectric，pI)与蛋白质的等电点相差较大时，可以预估该氨基酸对蛋白质的结构稳定可能存在负面效果。改变蛋白质表面的相应带电残基可能会引起突变位点周围，甚至是蛋白质催化活性部位周围的静电场发生改变，从而达到影响酶的热稳定性以及催化性能。研究表明，优化蛋白质表面电荷是一种提高酶催化性能的有效策略，该方法通过对酶蛋白表面的电荷-电荷间相互作用能进行计算预测，将蛋白表面不利于酶催化性能的带电氨基酸残基替换为丙氨酸或者相反电荷的氨基酸残基以达到提高其热稳定性和催化性能的目的。Schweiker等(SchweikerKL,Zarrine-AfsarA,DavidsonAR,etal.ComputationaldesignoftheFynSH3domainwithincreasedstabilitythroughoptimizationofsurfacechargechargeinteractions[J].ProteinScience.2007；16(12):2694-702)使用TK-SA模型合理优化FynSH3结构域表面电荷间相互作用能，成功地提高了该蛋白的稳定性，最稳定突变体的热解折叠温度(Tm)比野生型高12.3℃。Zhang等(ZhangLJ,TangXM,CuiDB,etal.Amethodtorationallyincreaseproteinstabilitybasedonthecharge–chargeinteraction,withapplicationtolipaseLipK107[J].ProteinScience.2014；23(1):110-6.)通过改进TK-SA模型算法，发布了一套新的设计算法-ETSS，运用ETSS算法预测位于脂肪酶Lipk107表面且对酶的稳定性至关重要4个残基(D113、D149、D213和D253)，利用酸性或中性氨基酸对4个位点的氨基酸进行替换得到4个Lipk107突变体(D113A、D149K、D213A和D253A)，研究结果显示，突变体D113A、突变体D149K、突变体D213A和突变体D253A在50℃下的半衰期(t1/2)分别是野生型的12倍、14倍、4.5倍和6倍，且突变体D253A的酶活力是野生型的1.2倍。Tu等(TuT,LuoH,MengK,etal.ImprovementinthermostabilityofanAchaetomiumsp.strainXz8endopolygalacturonaseviatheoptimizationofcharge-chargeinteractions[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2015；81(19):6938-44.)利用ETSS程序计算了多聚半乳糖醛酸酶带电氨基酸i点和j之间的总相互作用能(Eij)，推断出影响酶蛋白稳定性的9个残基，利用定点突变构建9个突变体，研究表明，突变体D244A和突变体D299R表现出较好的热稳定性；双突变体D244A/D299R的半失活温度(T50)和Tm分别比野生型提高17℃和10.2℃，其在50℃和55℃的t1/2分别比野生型延长8.4h和45min。目前尚无通过酶蛋白表面的电荷-电荷间相互作用能计算预测来提高土曲霉属(pergillusterreus)ω-转氨酶热稳定性的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术基于一种酶蛋白表面电荷电荷相互作用能的计算预测的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的土曲霉属(pergillusterreus)ω-转氨酶突变体。本专利技术利用一套新的表面电荷电荷相互作用能算法-ETSS，筛选与野生酶氨基酸序列中等电点处于劣势的氨基酸残基，作为优选突变氨基酸，进而利用定点突变技术进行改造。一种ω-转氨酶突变体，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述ω-转氨酶突变体为以下一种：(1)L118T/F115L/E133A三突变的突变体；(2)L118T/F115L/E133K三突变的突变体；(3)L118T/F115L/E253A三突变的突变体。野生型ω-转氨酶为土曲霉(Aspergillusterreus)来源的ω-转氨酶，基因序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。L118T/F115L双突变的突变体，基因序列如SEQIDNo.3所示，氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。L118T/F115L/E133A三突变的突变体，基因序列如SEQIDNo.5所示，氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。L118T/F115L/E133K三突变的突变体，基因序列如SEQIDNo.7所示，氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。L118T/F115L/E253A三突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ω-转氨酶突变体为以下一种：/n(1)L118T/F115L/E133A三突变的突变体；/n(2)L118T/F115L/E133K三突变的突变体；/n(3)L118T/F115L/E253A三突变的突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述ω-转氨酶突变体为以下一种：
(1)L118T/F115L/E133A三突变的突变体；
(2)L118T/F115L/E133K三突变的突变体；
(3)L118T/F115L/E253A三突变的突变体。


2.权利要求1所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。


3.一种催化(R)-(+)-α甲基苄胺生成苯乙酮的方法，其特征在于，使用权利要求1所述ω-转氨酶突变体进行催化反应。


4...

【专利技术属性】
技术研发人员：花雨娇，黄俊，曹佳仁，梅乐和，吕常江，王宏鹏，于林凯，周一峰，葛青，樊芳芳，李业，叶青文，陈思艺，张仪荻，
申请(专利权)人：花雨娇，
类型：发明
国别省市：浙江;33