本发明专利技术公开ALS突变蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明专利技术还公开编码该突变蛋白的核酸，含有该核酸的表达盒、重组载体或细胞。本发明专利技术还公开该突变蛋白、核酸、表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明专利技术还公开了获得具有除草剂抗性植物的方法以及抗性植物鉴定方法。本发明专利技术是在我国油菜中首次发现的双基因双突变位点的ALS抑制剂类除草剂乙酰乳酸合酶突变体；在田间喷施ALS抑制剂类除草剂苯磺隆和甲基二磺隆实验结果表明，含有本发明专利技术的ALS突变蛋白的油菜DS3在3‑4叶期施用16倍的杂草防治推荐使用浓度后，植株仍然正常生长发育和结实。
【技术实现步骤摘要】
具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用
本专利技术涉及植物抗除草剂和分子育种领域，具体涉及具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用。更具体地，涉及甘蓝型油菜高抗除草剂的乙酰乳酸合酶编码基因的分离、载体构建、培育高抗除草剂植物的方法。
技术介绍
油菜(BrassicanapusL.)是我国第一大油料作物之一，为我国半数以上的人口提供食用油来源。近年来，随着我国油菜种植方式由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展，杂草有效防治已成为油菜全程机械化生产、轻简化栽培的重要环节。化学除草是控制农田杂草经济有效手段。遗憾的是，由于缺少商业化的抗除草剂油菜品种，致使当前我国油菜生产化除面积非常有限。北美、欧洲等发达国家早以通过种植抗除草剂油菜实施化学除草。抗除草剂的品种类型主要有孟山都公司的抗草甘膦油菜、拜耳公司的抗草胺膦油菜和巴斯夫公司的抗咪唑啉酮油菜。这些抗性基因受国际知识产权保护，在我国商业化种植需要交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本，违背了种植抗除草剂作物的初衷。同时抗草甘膦油菜和抗草胺膦油菜均为转基因品种，在中国尚未批准商业化种植，无法在生产上应用。而咪唑啉酮类除草剂在土壤中残留期长，仅能在一熟制地区使用，在我国油菜主产区长江流域多熟制地区未能登记发放。因此，创制具有自主知识产权、适合我国生产需求的抗除草剂油菜新种质、挖掘抗性基因对油菜抗除草剂品种选育均具有十分重要的现实意义。乙酰乳酸合酶(Acetolactatesynthase，ALS)，也叫乙酰羟基酸合酶(Acetohydroxyacidsynthase，AHAS)，是植物和微生物3种支链氨基酸生物合成过程中的关键酶(McCourtJA，DugglebyRG.AminoAcids，2006，31：173-210)。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白质合成，最终导致植物生长受阻、直至死亡，因此以ALS为作用靶标开发了多种类型的高效除草剂，如磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones，IMI)等。这些除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂，具有选择性强、杀草谱广、使用剂量低、对哺乳动物毒性小等优点，在生产上得到广泛应用，已成为继草甘膦后的第2大类除草剂。然而，商业化的ALS类除草剂对双子叶作物油菜具有强烈的生长抑制作用，使其仅能在水稻、小麦、玉米等单子叶作物中应用。为此，培育抗性油菜品种，拓宽现有ALS类除草剂的应用范围，可有效解决这一难题。但是，由于缺少生具有产应用价值的抗性种质或基因，国内至今还没有培育出商业化的抗性油菜品种。ALS类除草剂的靶标ALS蛋白氨基酸位点的突变可以产生抗性植物，其中涉及氨基酸位点有Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)，这在多种农作物(包括水稻、玉米、小麦、向日葵等)、模式植物拟南芥和杂草中均有报道(Tanetal.，2005，PestManagSci，61：246-257)。研究发现，抗性植物的抗性效应取决于ALS上氨基酸突变的位置、突变后的氨基酸种类以及突变氨基酸的数目(Yuetal.，2010，JExpBotany，61：3925-3934)。同时不同遗传背景下相同位置的氨基酸变异产生的除草剂抗性效应也会存在显著差异，这很可能是由于不同遗传背景下植物中的不同微效基因参与了除草剂抗性的协同作用。所以，对于复杂遗传背景的作物(如油菜)，具有除草剂高度抗性的突变体及其确实能起决定性作用的物质(如蛋白、基因等)目前还没有理论来定向设计出，只能依赖于科研人员艰苦实践而获得，尤其是依赖长期筛选与鉴定，并且凭借运气才能获得。对于异源四倍体作物油菜来说，情况更为复杂，我们很难提前预测ALS蛋白氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，抗性突变位点的抗性水平是否具有育种利用价值，抗性种质或基因能否适合生产实用价值。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变体。本专利技术还要解决的技术问题是提供了编码该蛋白的核酸以及表达盒、载体和细胞等。本专利技术还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了判断植物是否采用本专利技术方法获得的鉴定方法。本专利技术人正是经过长期而艰苦的研究实践，凭借运气偶然地利用苯磺隆在油菜N131的两轮EMS诱变的突变体库中发现了一株高抗除草剂种质，该种质携带的乙酰乳酸合酶突变体属于双基因双位点突变，编码的蛋白具有对除草剂的高度抗性，从而赋予油菜具有对除草剂高度的抗性。截至本专利申请之前，此种类型油菜突变体在国内外均未见公开报道。本专利技术所述的乙酰乳酸合酶突变体与其他野生型乙酰乳酸合酶相比具有双基因双位点突变，将编码该突变酶的基因转育或转化到植物中，可使油菜、拟南芥等植物具有高抗ALS抑制剂类除草剂的特性。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了使得植物具有除草剂抗性的ALS突变蛋白，其在ALS1氨基酸序列的第182位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，在ALS3的第556位氨基酸由色氨酸变为亮氨酸。目前还没有报道表明，在来自甘蓝型油菜基因组中上述的双基因双突变，会使得油菜具有ALS抑制剂类除草剂高度抗性。优选本专利技术的第一方面的ALS1蛋白带有Pro182Leu突变，ALS3蛋白带有Trp556Leu，除了本专利技术具有的实施方式所述的突变植株筛选或扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情形下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法均为常规手段。在本专利技术的具体实施方式中，具有除草剂抗性的ALS蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。该蛋白经过证实为对SU类除草剂苯磺隆(2-[N-(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)-N-甲基氨基甲酰胺基磺酰基]苯甲酸甲酯)和甲基二磺隆(甲基-2[3-(4，6-＝甲氧基嘧啶-2-基)一脲基磺酰基l-4-甲磺酰基氨基苯甲酸酯)不敏感的乙酰乳酸合酶。本专利技术的第二方面提供了核酸，其编码本专利技术第一方面的蛋白质。在本专利技术中，核酸可以是DNA、RNA，其中优选为DNA。在已知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本专利技术第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本专利技术第二方面的核酸，其ALS1核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS 突变蛋白包含ALS1和ALS3，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示，ALS3 氨基酸序列如SEQ ID NO：4 所示。/n
【技术特征摘要】
1.ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白包含ALS1和ALS3，其ALS1氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.核酸，其编码权利要求1所述的ALS突变蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸，其ALS1核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，ALS3核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
4.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求2或3所述的核酸。
5.权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的核酸，权利要求4所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
6.根据权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡茂龙，浦惠明，龙卫华，高建芹，张洁夫，陈松，彭琦，陈锋，付三雄，周晓婴，张维，王晓东，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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