2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用制造技术

本发明专利技术涉及食品检测领域，具体涉及2‑癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用。在蜂蜜的真实性评价方法中，以2‑癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2‑癸烯二酸的含量介于4.0‑8.0 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2‑癸烯二酸的含量低于4.0 mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。本发明专利技术中提供的方法具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对制定蜂蜜真实性评价的相关行业或国家标准具有一定的指导意义，同时对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用
本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、蜜露与自身分泌物相混合，经充分酿造，储存在蜂巢中的一种天然甜味食品。由于蜂蜜中含有丰富氨基酸、酚酸、黄酮、维生素等有益物质，且具有良好的养颜、润肠、滋补等功效，深受广大人们群众的喜爱，但是市场上销售的蜂蜜却存在一定的掺假行为。果糖、葡萄糖和水分是蜂蜜中最主要的组成部分，三者占到了蜂蜜总质量的95%以上，因此，蜂蜜是一种非常易于掺假的商品。据欧盟食品药品管理委员会统计，蜂蜜掺假在所有食品掺假中位居第三，仅次于果汁和橄榄油掺假。蜂蜜掺假的形式多种多样，其中最为普遍是在蜂蜜中勾兑大量的果葡糖浆，勾兑比例高达30-100%。蜂蜜的生产依赖蜜蜂养殖，具有养殖环境恶劣、费工费时、生产周期较长等弊端；而高纯度果葡糖浆的原料来源有大米、淀粉、玉米、甜菜等，同过现代酶解和纯化工艺可以进行工厂化生产，生产成本显著低于蜜蜂养殖收获的蜜蜂。当前，我国现行的蜂蜜国家标准中主要是按照食品卫生标准进行制定，缺乏有关蜂蜜真实性评价的相关指标。基于同位素比值构建的蜂蜜掺假判别方法能够有效的鉴别蜂蜜中勾兑玉米等C4植物生产的果葡糖浆，而对当前以大米、小麦等C3植物生产的果葡糖浆束手无策。此外，随着果葡糖浆生产工艺的提升，其纯度不断提高，当前开发的蜂蜜掺假判别方法往往滞后于果葡糖浆工艺的改进，这使得基于糖浆特征性物质构建蜂蜜掺假判别方法的生命周期日益缩短。如何有效地鉴别蜂蜜掺假，评价蜂蜜的真实性已经成为广大蜂产品行业从业者的共识。基于果葡糖浆特征性物质构建的蜂蜜掺假判别方法属于被动策略，它需要针对糖浆制备工艺的提升，不断升级改造蜂蜜掺假鉴别方法。而基于蜂蜜中固有的内源性物质构建的蜂蜜掺假判别方法可以有效地弥补基于糖浆特征物进行掺假鉴别的不足。蜂蜜中内源性物质非常丰富，包含数千种小分子化合物和大分子蛋白质等物质。但这些物质的来源主要两个途径：一是蜜源植物的花蜜或蜜露；二是蜜蜂在酿蜜过程中混入的分泌物。由于蜜源植物的种类高达数千种，难以基于蜜源植物来源的物质，构建统一的蜂蜜掺假鉴别方法。而我国饲养蜜蜂品种非常有限，仅有意大利蜜蜂和中华蜜蜂，其中我国意大利蜜蜂约600万群，是我国蜂蜜供给的主要来源，占到市场上流通商品蜂蜜的90%以上。因此，基于蜜蜂来源的物质非常适合构建统一的蜂蜜掺假判别方法。基于蜜蜂来源的物质主要是由蜜蜂咽下腺和上额腺分泌的物质，主要有各种酶类、王浆主蛋白等大分子，以及部分中长链脂肪酸等小分子物质。蜂蜜中部分来源于蜜蜂的小分子物质具有含量稳定等优点，当蜂蜜中勾兑果葡糖浆等物质之后，其固有的内源性物质发生稀释，含量降低。因此，基于蜂蜜中固有的内源性物质含量范围，设定含量阈值，制定统一的蜂蜜真实性评价方法。本专利技术基于该策略提供了一种新型的蜂蜜掺假判别方法，该方法具有简单、快速、方便、实用性强等优点，非常适合蜂蜜样本的掺假鉴别。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术首先采用高效液相色谱串联高分辨质谱(UHPLC-HRMS)的正负模式对来自不同年份、产地和蜜源植物的蜂蜜样品进样分析，发现所有蜂蜜在负模式情况下存在一个特征性的色谱峰(m/z199.09758)，显著区别于花蜜，而且该物质的MS/MS图谱中存在一个丰度较高的碎片离子m/z155.10666。基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z199.09758，获得该物质的元素组成为C10H15O4-，采用CompoundDiscoverer2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/zCloud、ChemBank等。试验结果表明，该化合物与癸二酸具有相识的质谱和色谱特征，两者在m/z上仅存在2个氢原子的差异，暗示着该化合物为癸二酸的脱氢产物。此外，在m/z199.09758物质的MS/MS图谱中的碎片离子m/z137.09609、m/z181.08592与癸二酸MS/MS谱图中m/z139.11174、m/z183.10157同样相差2个氢原子，再次表明上述推断的正确性。癸二酸是蜜蜂体内脂肪酸氧化代谢的一个中间产物，他主要是通过长链脂肪酸通过β-氧化途径生成。同样的，癸二酸会继续通过β-氧化生成其它降解产物。β-氧化的第一步便是对β位置的C原子发生脱氢反应，故推测m/z199.09758为2-癸烯二酸，结构如下：。为保证2-癸烯二酸鉴定结果的准确性，本专利技术采用半制备色谱从蜂蜜样本中提取、纯化出了少量该物质，然后采用核磁共振(NMR)获得该物质的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13H-NMR)信息，详细数据见表1。由该化合物的碳谱和氢谱数据可知，与癸二酸的相比，该物质2位和3位的碳原子发生了显著的位移，3位的碳谱由原来的24.7ppm位移至153.6ppm，而2位的碳谱由原来的34ppm位移至120.4ppm，而其它位置的碳原子的位移不显著，表明2-癸烯二酸结构的正确性。此外，氢谱数据表明：与癸二酸的相比，该物质2位和3位的氢原子均减少了1个，而且3位的氢谱由原来的1.54ppm位移至7.11ppm，而9位的碳谱由原来的2.11ppm位移至6.02ppm，再次验证2-癸烯二酸化学结构的正确性。表12-癸烯二酸的核磁共振碳谱和氢谱信息此外，本专利技术通过对大量蜂蜜样本的分析，发现不同年份、产地和蜜源植物的蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量均介于4.0-8.0mg/kg，足见该物质在蜂蜜中的含量较为稳定。因此，可以基于2-癸烯二酸含量作为蜂蜜的真实性鉴别的指示性物质，用于评价蜂蜜中是否掺假。基于上述发现，本专利技术首先提供2-癸烯二酸在蜂蜜的真实性评价中的应用。进一步的，本专利技术提供一种蜂蜜的真实性评价方法，包括：以2-癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量介于4.0-8.0mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量低于4.0mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。作为优选，通过加入2-癸烯二酸的花蜜确认癸烯二酸的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂蜜样本中2-癸烯二酸的峰面积推算其含量。作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。作为优选，2-癸烯二酸在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z199.09758([M-H]-)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；优选2-癸烯二酸色谱峰的保留时间为9.38min，保留时间允许的偏差应小于0.2min。此外，为了提高蜂蜜的鉴别能力，2-癸烯二酸的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有其主要的碎片离子，本专利技术进一步发现了其特征碎片离子：m/z155.10666、m/z137.09609、m/z156.10982、m/z164.83499、m/z83.04867，其精确质量数的误差应当小于10ppm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.2-癸烯二酸在蜂蜜的真实性评价中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.2-癸烯二酸在蜂蜜的真实性评价中的应用。


2.一种蜂蜜的真实性评价方法，其特征在于，包括：以2-癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量介于4.0-8.0mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量低于4.0mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。


3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。


4.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，2-癸烯二酸在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z199.09758[M-H]-准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；2-癸烯二酸色谱峰的保留时间为9.38min，保留时间偏差小于0.2min。


5.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，2-癸烯二酸的MS/MS图谱中应含有m/z155.10666、m/z137.09609、m/z156.10982、m/z164.83499、m/z83.04867中的一个或多个碎片离子峰，其精确质量数的误差应当小于10ppm。


6.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0min，5%的流动相B；2.0-7.0min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0min，95%的流动相B；18.0-18.1min，95-5%的流动相B；18....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，张玉豪，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11