一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备及应用方法技术

一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备方法，包括如下步骤：步骤①.打磨清洗玻碳电极；步骤②.电极活化；步骤③.将碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料滴涂于经过活化后的玻碳电极表面，至玻碳电极表面形成固体薄膜；步骤④.将纳米金溶液滴涂在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上方，形成纳米金固体薄膜；步骤⑤.将猪瘟抗体稀释液滴涂于步骤④得到的电极纳米金固体薄膜层上方，形成猪瘟抗体固化薄膜；制得所述免疫传感器。本发明专利技术还公开了上述传感器的应用方法。本发明专利技术利用碳纳米管/锰酸镍/纳米金纳米复合材料制备猪瘟病毒免疫传感器，将复合材料用于传感器传感界面的构建，以达到提高传感器灵敏度的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备及应用方法
本专利技术属于非洲猪瘟病毒免疫传感器的制备领域，具体涉及一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备及应用方法。
技术介绍
非洲猪瘟病毒的准确检测对于生物医学和畜牧养殖业来说具有十分重要的价值。自上世纪五十年代猪瘟病毒首次传播出非洲以来，覆盖面积从非洲扩大到欧洲，拉丁美洲和南美洲，以及亚洲大陆，历史上多次爆发，造成大量的生猪死亡，造成不可估量的经济损失，在此期间花费了大量的人力物力来进行防疫，仍不可避免。百分百死亡率令猪瘟病毒的危害性不断在世界范围内增大，其快速检测手段一直是生物医学的一大难题。目前的检测手段通过检测定量的血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体的方式来测定病毒的含量。目前的检测手段有：应用聚合酶链式反应（PCR）检测非洲猪瘟病毒基因组；直接荧光抗体法对非洲猪瘟抗原的检测；ELISA对非洲猪瘟抗原的检测。目前实际应用最广泛的是实时荧光PCR检测试剂盒，间接ELISA诊断试剂盒。这两种试剂盒检测准确度是相当准确的，但是这些检测方法都有检出限不够低，价格昂贵，保存周期短的特性。电化学分析方法是低成本、高可靠性、易于操作的一种检测方法，已经在很多检测方向有应用，电化学免疫传感器是利用抗体抗原之间具有唯一识别和结合功能，再与电极组合而成的检测装置，分为直接型和间接型两类，分别通过检测抗原抗体发生免疫反应的特征信号转化为电信号和将抗原抗体制成膜将特征信号转化为中间信号。电化学免疫传感器的方法利用抗体抗原的免疫反应具有高灵敏性，高专一性的特点，相对于以前的检测方法，电化学免疫传感器的方法检测限低、检测范围宽、稳定性良好、成本低等优点。在现有技术中，目前实际应用最广泛的是实时荧光PCR检测试剂盒，间接ELISA诊断试剂盒检测的范围不大，检出限不够低，使用不够方便。因此，对于非洲猪瘟的检测预防不能够及时及早的做出反应，不利于快速阻断传染和防止瘟疫蔓延。
技术实现思路
为克服现有技术存在的缺陷，本专利技术公开了一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备及应用方法。本专利技术所述锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤①.将玻碳电极依次通过直径0.3um以上和直径0.05um以下的氧化铝粉末打磨10-20分钟，用超纯水冲洗干净，再置于无水乙醇中超声波清洗5~10分钟随后置于超纯水中再次超声波清洗5~10分钟；步骤②.将清洗后的玻碳电极置于硫酸溶液中，循环伏安扫描法扫描15~25圈使电极活化，电位范围为-0.8V~1.8V；活化完成后用超纯水冲洗干净，置于超纯水中备用；步骤③.将碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料滴涂于经过活化后的玻碳电极表面，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h，直至玻碳电极表面形成一层均匀的固体薄膜；步骤④.将纳米金溶液滴涂在步骤③中得到的位于玻碳电极表面的碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h使之在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成一层稳定吸附的纳米金粒子；步骤⑤.将猪瘟抗体稀释液滴涂于步骤④得到的吸附有纳米金粒子的薄膜层上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成猪瘟抗体薄膜，制备得到所需电极。优选的：所述碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料的制备方法为：将锰酸镍粉、碳纳米管、超纯水按1：2-3：45-48的体积比配置于离心管中，用超声波清洗仪在超纯水中超声波清洗24-48小时，直至液体中无肉眼可见颗粒物。优选的：所述纳米金溶液的制备方法为：分别配制质量分数为0.01%氯金酸以及质量分数为1%的柠檬酸三钠；取质量分数为0.01%的氯金酸于烧瓶中并在油浴锅中在98-100℃下加热搅拌至沸腾；迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液；氯金酸和柠檬酸三钠的体积比为100：2-4；继续搅拌10-20分钟后；移去加热源，继续加热10-20分钟，将溶液收集置于玻璃冷冻管，于0-4℃温度条件下保存。本合成方法中柠檬酸钠不仅是还原剂，还是分散剂，制得的金纳米粒子表面吸附了带负电荷的柠檬酸根离子而相互排斥，在溶液中分散性好，处于均匀分散的稳定状态，溶液颜色为酒红色。优选的：所述猪瘟抗体稀释液的制备方法为：取猪瘟快速检测试剂盒中的酶标结合液,即猪瘟抗体原液加入超纯水稀释100倍，得到1%原浓度猪瘟抗体稀释液。本专利技术还公开了一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器应用方法，其特征在于：包括如下步骤：1）检测底液制备：将磷酸氢二钾加入超纯水溶解定容制备成浓度为0.05-0.1mol/L的PBS缓冲溶液A液；将磷酸二氢钠加入超纯水溶解定容制备成浓度与所述A液相同的PBS缓冲溶液B液；将A、B液以一定的比例混合成pH=7.0的PBS缓冲溶液；取猪瘟抗原病毒原溶液加入超纯水配成1.0000×10-1ug/mL的猪瘟病毒抗原溶液并使用超纯水继续梯度稀释配置成用于检测的一系列浓度为梯度变化的猪瘟抗原标准液；2）样品处理：将猪瘟快速检测试剂盒中的酶标结合液和去离子水按1:100的比例混合摇匀待用；3）检测：所述检测包括标准曲线的测定和样品测定；标准曲线测定：在三电极检测体系下，移取5-10mLPBS缓冲溶液于电解槽中，从最低浓度开始依次取猪瘟抗原标准液，所述三电极检测体系中用所述制备方法制得的玻碳电极作为工作电极；每个浓度按照1μL、2μL、4μL、5μL、7μL、9μL、10μL依次累加取液加入到电解槽中，每次累加都利用循环伏安检测一次；每次累加后使底液混合均匀后静置1~2分钟，使电解槽中反应完全，再进行检测，检测完成后绘制出该浓度的标准曲线；更换不同浓度，重复上述检测，若两个浓度检测曲线不重合，线性方向不变，可继续累加检测，底液不用清除。样品测定：将样品稀释至少100~150倍，在上标准曲线测量的工作条件下，移取5mLpH=7.00的PBS缓冲溶液于电解槽中，将制备好的样品液10μL搅拌2min混合均匀后检测，直至上一浓度梯度与下一浓度梯度检测曲线重合即停止检测，代表抗体消耗完毕,并由上述步骤得到的标准曲线，通过标准曲线上的电流信号，找出相同电流信号对应的浓度，从而推断出样品浓度。优选的：铂电极作为对电极，饱合甘汞电极作为参比电极。优选的：检测过程中的工作条件为：CV检测的静置时间为2s，初始电压为-0.76V，顶点电压为0.55V，采样间隔为0.02V，扫描速度为0.05V/s，灵敏度为1μA/V。采用本专利技术所述锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备及应用方法，具有如下优越性:1.本专利技术利用碳纳米管/锰酸镍/纳米金纳米复合材料制备猪瘟病毒免疫传感器，将复合材料用于传感器传感界面的构建，以达到提高传感器灵敏度的效果。再利用猪瘟抗体与抗原的特征免疫反应的原理进行实验，将抗体抗原的特征免疫反应信号转化为电信号，不仅灵敏度高，专一性高，同时具有检测方法简单、携带方便、成本低等优点；2.本专利技术对猪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤①.将玻碳电极依次通过直径0.3um以上和直径0.05um以下的氧化铝粉末打磨10-20分钟，用超纯水冲洗干净，再置于无水乙醇中超声波清洗5~10分钟随后置于超纯水中再次超声波清洗5~10分钟；/n步骤②.将清洗后的玻碳电极置于硫酸溶液中，循环伏安扫描法扫描15~25圈使电极活化，电位范围为-0.8V~1.8V；活化完成后用超纯水冲洗干净，置于超纯水中备用；/n步骤③.将碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料滴涂于经过活化后的玻碳电极表面，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h，直至玻碳电极表面形成一层均匀的固体薄膜；/n步骤④.将纳米金溶液滴涂在步骤③中得到的位于玻碳电极表面的碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h使之在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成一层稳定吸附的纳米金粒子；/n步骤⑤.将猪瘟抗体稀释液滴涂于步骤④得到的吸附有纳米金粒子的薄膜层上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成猪瘟抗体薄膜，制备得到所需电极。/n...

【技术特征摘要】
1.一种锰酸镍材料检测猪瘟病毒免疫传感器制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤①.将玻碳电极依次通过直径0.3um以上和直径0.05um以下的氧化铝粉末打磨10-20分钟，用超纯水冲洗干净，再置于无水乙醇中超声波清洗5~10分钟随后置于超纯水中再次超声波清洗5~10分钟；
步骤②.将清洗后的玻碳电极置于硫酸溶液中，循环伏安扫描法扫描15~25圈使电极活化，电位范围为-0.8V~1.8V；活化完成后用超纯水冲洗干净，置于超纯水中备用；
步骤③.将碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料滴涂于经过活化后的玻碳电极表面，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h，直至玻碳电极表面形成一层均匀的固体薄膜；
步骤④.将纳米金溶液滴涂在步骤③中得到的位于玻碳电极表面的碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h使之在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成一层稳定吸附的纳米金粒子；
步骤⑤.将猪瘟抗体稀释液滴涂于步骤④得到的吸附有纳米金粒子的薄膜层上方，将电极倒置于4~8℃环境下保存4~8h在碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料固体薄膜上形成猪瘟抗体薄膜，制备得到所需电极。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述碳纳米管/锰酸镍纳米复合材料的制备方法为：将锰酸镍粉、碳纳米管、超纯水按1：2-3：45-48的体积比配置于离心管中，用超声波清洗仪在超纯水中超声波清洗24-48小时，直至液体中无肉眼可见颗粒物。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述纳米金溶液的制备方法为：分别配制质量分数为0.01%氯金酸以及质量分数为1%的柠檬酸三钠；取质量分数为0.01%的氯金酸于烧瓶中并在油浴锅中在98-100℃下加热搅拌至沸腾；迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液；氯金酸和柠檬酸三钠的体积比为100：2-4；
继续搅拌10-20分钟后；移去加热源，继续加热10-20分钟，将溶液收集置于玻璃冷冻管，于0-4℃温度条件下保存；
本合成方法中柠檬酸钠不仅是还原剂，还是分散剂，制得的金纳米粒子表面吸附了带负电荷的柠檬酸根离子而相互排斥，在溶液中分散性好，处于均匀分散的稳定状态，溶液颜色为酒红色。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述猪瘟抗体稀释液的制备方法为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅小红，杨敏，钟思琦，张琴，梅丽，尚书勇，
申请(专利权)人：成都师范学院，
类型：发明
国别省市：四川;51