抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的B细胞抗体基因获取方法及其免疫组库研究技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体脑炎患者的B细胞表面受体(B cell receptor,BCR)或抗体基因的单细胞获取方法，并进一步公开所述抗N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体脑炎患者的B细胞的免疫组库研究。本发明专利技术所述单个B细胞人源抗体基因可变区和恒定区扩增的方法，基于单个B细胞反转录和BCR扩增方法，首次利用抗原‑‑抗体特异性结合的特点，用流式细胞术预先筛选出与抗N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体脑炎的致病抗原NR1蛋白亚基结合的阳性B细胞，减少了其他非阳性BCR/抗体信息的干扰，减少了不必要的工作量，使得我们最后获得的抗体信息与该疾病的相关性更强，对单细胞B细胞抗体序列捕获的效率更高，且实验步骤更简便、操作性更强。

【技术实现步骤摘要】
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的B细胞抗体基因获取方法及其免疫组库研究
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的B细胞抗体基因获取方法，并进一步公开所述抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎患者的B细胞的免疫组库研究。
技术介绍
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate-receptor，N-甲基-D-天冬氨酸受体)脑炎简称抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎，是一种自身免疫性脑炎，被收录在2018年5月22日由国家卫生健康委员会、科技部、工业和信息化部、国家药品监督管理局、国家中医药管理局等五部门联合发布的《第一批罕见病》中，该病症主要是由鞘内产生针对N-甲基-D-天冬氨酸受体的特异性抗体而导致的发病。因此，对于该病的研究须以脑脊液为样本，而患者脑脊液中B细胞数量往往很少，只能用低通量单个B细胞抗体基因扩增方法来进行研究。目前已经开发出多种成熟的商业化平台可以用于单个B细胞扩增人源抗体基因重链和配对轻链，如李新洋等《从单个B细胞扩增全人源抗体重链和轻链基因方法的建立》本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单个B细胞人源抗体基因可变区和恒定区扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)脑脊液阳性单个B淋巴的分离/n取新鲜脑脊液离心，并用冻存液重悬细胞，并放进程序性冻存盒内，保存，备用；/n待到做流式之前取胎牛血清加入1640培养基于混匀，离心弃上清；加入细胞染色缓冲液混匀，按比例加入荧光抗体；避光室温孵育；继续加入细胞染色缓冲液，离心重复洗涤；继续加入细胞染色缓冲液重悬细胞；并加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚染核后上机；/n配制单细胞裂解液：包含18个胸腺嘧啶的寡核苷酸引物(5’-3’：TTTTTTTTTTTTTTTTTT，10微摩尔/升)，RNA酶抑制剂，聚乙二醇辛基苯基醚(10...

【技术特征摘要】
20200630 CN 20201060701111.一种单个B细胞人源抗体基因可变区和恒定区扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脑脊液阳性单个B淋巴的分离
取新鲜脑脊液离心，并用冻存液重悬细胞，并放进程序性冻存盒内，保存，备用；
待到做流式之前取胎牛血清加入1640培养基于混匀，离心弃上清；加入细胞染色缓冲液混匀，按比例加入荧光抗体；避光室温孵育；继续加入细胞染色缓冲液，离心重复洗涤；继续加入细胞染色缓冲液重悬细胞；并加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚染核后上机；
配制单细胞裂解液：包含18个胸腺嘧啶的寡核苷酸引物(5’-3’：TTTTTTTTTTTTTTTTTT，10微摩尔/升)，RNA酶抑制剂，聚乙二醇辛基苯基醚(100毫升/升)，包括：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP，4种在内的脱氧核苷酸等摩尔混合物(10毫摩尔/升)，并以无核酸酶水补齐剩余所需体积，将裂解液置于聚合酶链式反应管中，冰上放置，经流式细胞仪分选4',6-二脒基-2-苯基吲哚阴性和弱阳性(代表细胞还活着)的目的细胞(CD20+NR+)到含有裂解液的聚合酶链式反应管中，分选后标记好立即置于液氮中；
(2)单个B细胞反转录和BCR/抗体基因扩增
将分好细胞的含有裂解液的聚合酶链式反应管置于聚合酶链式反应仪内进行裂解，裂解结束后，立即置于冰上；
配制6微升反转录体系：合成第一条链的超级二代缓冲液(SuperScriptⅡFirst-StandBuffer)(5×)，甜菜碱(5摩尔/升)，MgCl2(100毫摩尔/升)，二硫苏糖醇(100毫摩尔/升)，TSO(100微摩尔/升)，RNA酶抑制剂(4U)，第二代超级逆转录酶(SuperScriptⅡReverseTranscriptase)；
按照如下条件进行逆转录：42℃60分钟-90分钟；50℃2分钟，42℃2分钟，10个循环；70℃15分钟；4℃或12℃，∞，获得cDNA；
以上述步骤获得的单管cDNA体系产物为模板进行两轮巢式聚合酶链式反应：第一轮使用IS引物和重轻链CH1区下游引物(标记为CIR2)，配制25微升聚合酶链式反应体系：热启动HiFi高保真酶(厂商：KapaBiosystems)，IS引物(10微摩尔/升)，CIR2引物(10微摩尔/升)，逆转录产物，以无核酸酶水补齐剩余所需体积，可根据需求适量扩增体系；第二轮聚合酶链式反应使用V区引物(标记为VH为重链上游引物，标记为VL和VK的为轻链上游引物)和JH引物(重链下游)或者CH1区引物(标记为IGLC和IGKC，轻链下游)；
配制25微升聚合酶链式反应体系：热启动HiFi高保真酶(厂商：KapaBiosystems)，轻链和重链上游引物(VH/VL/VK)引物(10微摩尔/升)，轻链和重链下游引物(JH/CH1)引物(10微摩尔/升)，第一轮聚合酶链式反应产物、无核酸酶水补齐剩余所需体积，可根据需求适量扩增体系；
两轮聚合酶链式反应都设置如下扩增条件：95℃3分钟；98℃20s，58℃-62℃20s，72℃30s-45s，20-25个循环；72℃5分钟；4℃或12；经巢式聚合酶链式反应后的产物经琼脂糖凝胶电泳；
重链回收400bp左右目的条带，轻链回收450bp左右条带，凝胶回收产物+连接载体，25℃连接30分钟或4℃过夜，连接产物中加入感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激30s-45s，冰上静置2分钟及以上，随后加入LB培养基200微升，摇床37℃，200rpm摇50分钟-1小时，经蓝白斑筛后进行一代测序。


2.根据权利要求1所述单个B细胞人源抗体基因可变区和恒定区扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脑脊液阳性单个B淋巴的分离
取新鲜脑脊液经过0-4℃运输，立即以1200rpm的转速离心10分钟，用500微升冻存液(90％胎牛血清+10％二甲基亚砜)重悬细胞，并放进程序性冻存盒内，-80℃保存，备用；
待到做流式之前取1ml胎牛血清(4℃)加入15ml的1640培养基于4℃混匀，250g离心5分钟-12分钟，弃上清；加入1ml细胞染色缓冲液混匀，按比例加入荧光抗体，(抗B细胞表面CD20分子抗体-甲藻素叶绿素蛋白青色素串联偶联物(anti-CD20-Percp/Cy5.5)，抗B细胞表面分子CD27抗体--别藻青蛋白(anti-CD27-APC)，抗B细胞表面分子CD38抗体--藻红蛋白(anti-CD38-PE)；避光室温孵育15-20分钟；继续加入2ml细胞染色缓冲液，250g离心5分钟，重复洗涤2次；继续加入0.5-1ml细胞染色缓冲液重悬细胞；并加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(3微摩尔/升，加500微升/管)染核后5分钟左右上机；
配制4微升裂解液/管：1微升包含18个胸腺嘧啶的寡核苷酸引物(5’-3’：TTTTTTTTTTTTTTTTTT，10微摩尔/升)，0.1微升-0.2微升RNA酶抑制剂(4U)，0.04微升聚乙二醇辛基苯基醚(100毫升/升)，1微升包括：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP，在内的脱氧核苷酸等摩尔混合物(10毫摩尔/升)，并以...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，
申请(专利权)人：中国科学院心理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11