一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种将多肽从复杂体系黄酒中多级分离纯化的工艺方法，包括黄酒的预处理除杂、超滤、大孔树脂吸附和葡聚糖凝胶色谱层析。同时根据此工艺方法分离纯化出一种黄酒多肽并进行氨基酸结构鉴定，获得一种黄酒多肽为Leu‑Phe‑Trp(LFW)。同时提供了一种评价多肽免疫调节功能活性的应用方法，在RAW264.7细胞模型中，在LPS刺激下经黄酒多肽组分LFW的预处理明显抑制了促炎因子TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的表达，具有免疫调节功能，具备极高的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用
本专利技术涉及一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用，属于食品

技术介绍
黄酒的酿造历史悠久，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒。黄酒中蛋白质、多肽和游离氨基酸的含量丰富，平均氨基酸含量为13.5g/L，含量是啤酒的7.55倍，是白酒的2.09倍。黄酒多肽主要来源于原料分解与微生物代谢积累，酿造黄酒的原料如糯米等富含丰富的蛋白质，微生物体内含有各种代谢酶，因此在发酵过程中可以产生多种不同功能的活性肽。随着生活水平的提高，人们在饮食和饮酒方面越来越注重健康性，低度、营养、相对健康的黄酒对酒类爱好者的吸引逐渐增加，促进了黄酒行业的迅猛发展。黄酒自古以来具有养生酒的功效，但是黄酒摄入对人体健康的具体影响，如抗氧化、降血脂等功能仍有待研究。并且黄酒中发挥有益作用的功效成分还有待挖掘。黄酒多肽源于食品原料和微生物发酵，天然功效较强，毒副作用较小，具有比药物更高的安全性。因此在大健康背景下，分离纯化出黄酒多肽并评价其功能活性十分必要，具有较高的经济和研究价值。但是，黄酒成品酒体系复杂，成分多样，分离纯化活性多肽具有难度。同时黄酒多肽的功能活性评价较为欠缺，无法明确黄酒的功能性效果。
技术实现思路
为解决黄酒体系复杂活性物质难以分离纯化的问题，本专利技术提供了一种分离纯化和制备高纯度黄酒多肽的工艺，并应用体外细胞实验评价其功能活性。本专利技术提供了一种黄酒多肽，所述黄酒多肽的氨基酸序列为亮氨酸-苯丙氨酸-色氨酸。本专利技术提供了所述多肽在制备清除自由基、辅助抗癌、辅助抗氧化和/或辅助抗衰老的产品中的应用，利用所述的黄酒多肽清除自由基。在本专利技术的一种实施方式中，所述自由基包括超氧阴离子自由基、羟自由基、羧自由基、脂氧自由基、一氧化氮自由基、硝基自由基或超氧化氢自由基中的至少一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述多肽在所述产品的浓度为200～1800μg/mL或200～1800μg/mg。本专利技术提供了所述多肽在制备降低促炎症因子的产品中的应用，利用所述的黄酒多肽降低促炎因子。在本专利技术的一种实施方式中，所述促炎因子包括TNF-α、TNF-β、IL-6、IL-1β，激肽、组织胺、IL-2或前列腺素中的至少一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述多肽在产品中的浓度为50～200μg/mL或50～200μg/mg。本专利技术提供了一种制备所述多肽的方法，所述方法包括：(1)黄酒预处理：将黄酒过膜抽滤，得到抽滤液；(2)将抽滤液经超滤系统分离，取分子量不大于3kDa的组分；(3)将分子量不大于3kDa的组分通过大孔树脂吸附，得到粗多肽；(4)将粗多肽经凝胶色谱层析，收集洗脱液。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中的大孔树脂为DA201-C极性大孔吸附树脂；洗脱液为50％～70％的乙醇。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种评价黄酒多肽免疫调节功能活性的应用方法。由于巨噬细胞在急性免疫应答中起关键作用，以LPS为刺激物建立体外炎症模型，通过对LPS诱导的RAW264.7细胞释放细胞因子的水平来评价免疫调节活性的强弱。在人体的疾病发生和发展过程中，当组织或免疫系统发生炎症时，免疫相关细胞会产生大量信号分子使免疫系统做出相应的反应，这些信号分子包括各种促炎因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β等。本专利技术中，经黄酒多肽LFW样品预处理4h后再由LPS刺激，随着样品浓度由50μg/mL提高至200μg/mL，相关促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量明显得到抑制，表明分离纯化得到的黄酒多肽LFW具有明显的调节免疫因子的作用。因此，本专利技术所分离纯化得到的黄酒多肽组分具有免疫调节功能，具备极高的应用前景。附图说明图1为黄酒多肽LFW的质谱分析结果图。图2为黄酒粗多肽C和黄酒多肽LFW的抗氧化活性评价图。图3为黄酒多肽LFW对细胞存活率的影响图。图4为黄酒多肽LFW对细胞免疫促炎因子的调节作用图。具体实施方式下式实施例中涉及的黄酒购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司的黄酒酒精度均为15～18％vol，半干型黄酒。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购于中国科学院上海细胞库。实施例1：黄酒多肽LFW的分离纯化应用和氨基酸结构鉴定(1)黄酒的预处理除杂：采用循环水式真空泵抽滤黄酒通过0.22μm的微孔滤膜，可去除黄酒中分子量较大的固形物。所用的超滤组件需经过0.1mol/LNaOH溶液洗涤处理，并用蒸馏水洗至流出液为中性方可使用。(2)超滤分离：通过超滤系统分级超滤酒样，得到小于3kDa的组分，取小于3kDa的组分进一步分离纯化。(3)大孔树脂吸附：对大孔树脂进行预处理，使用95％乙醇浸泡DA201-C(比表面积为550-600m2/g，平均孔径为100-110A°，粒径范围为0.3～1.26mm，含水量为65-76％)大孔树脂24h后，使用蒸馏水清洗大孔树脂，直至流出液无明显乙醇气味并清澈透明。分别用1mol/L的HCl和4％的NaOH浸泡24h，以去除树脂在合成过程中的杂质，树脂洗至中性后滤去多余水分备用；取10g(干重)处理后的树脂置于锥形瓶中，加入步骤(2)得到的小于3kDa的组分100mL，于25℃、150r/min条件下吸附24h，收集吸附黄酒多肽后的DA201-C大孔树脂，抽滤去除滤液，用适量蒸馏水冲洗滤干后加入60％乙醇溶液，抽滤后测定多肽含量。随后进行洗脱，洗脱液经旋蒸去除乙醇后冻干，得到黄酒粗多肽组分，即为C组分。(4)凝胶色谱层析：使用SephadexG-15葡聚糖凝胶预处理及装柱，装柱后用蒸馏水平衡2个柱体积至检测器基线平稳。用蒸馏水将黄酒粗多肽组分配制成浓度为16mg/mL的溶液，经0.22μm微孔膜过滤后经过凝胶过滤分离层析系统，以蒸馏水(pH7.0)为流动相，流速为3mL/min，收集洗脱液，合并同一分离峰的洗脱液进行冷冻干燥后得黄酒多肽分离纯化组分，经氨基酸结构鉴定(氨基酸结构鉴定使用电喷雾离子阱质谱仪将多肽进行还原烷基化后经反相色谱分离，鉴定出相应的氨基酸序列)，其氨基酸序列为亮氨酸-苯丙氨酸-色氨酸(Leu-Phe-Trp，LFW)，质谱图如图1所示。其疏水氨基酸占比为2/3，分子量为464.24Da。实施例2：黄酒粗多肽C和黄酒多肽LFW的抗氧化活性评价应用体外DPPH和ABTS自由基清除实验评价两种黄酒多肽的抗氧化活性。其中黄酒多肽和抗坏血酸(Vc)的配制：取冷冻干燥后样品，以去离子水溶解后以2mg/mL进行浓度梯度稀释；准确称量20mg抗坏血酸溶于10mL去离子水中，按照浓度梯度2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL制备样液。...

【技术保护点】
1.一种黄酒多肽，其特征在于，所述黄酒多肽的氨基酸序列为亮氨酸-苯丙氨酸-色氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄酒多肽，其特征在于，所述黄酒多肽的氨基酸序列为亮氨酸-苯丙氨酸-色氨酸。


2.权利要求1所述多肽在制备清除自由基、辅助抗癌、辅助抗氧化和/或辅助抗衰老的产品中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述自由基包括超氧阴离子自由基、羟自由基、羧自由基、脂氧自由基、一氧化氮自由基、硝基自由基或超氧化氢自由基中的至少一种。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽在所述产品中的浓度为200～1800μg/mL或200～1800μg/mg。


5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。


6.权利要求1所述多肽在制备降低促炎症因子含量、或减轻炎症的产品中的应用。


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【专利技术属性】
技术研发人员：毛健，史瑛，周志磊，姬中伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32