梳式斑点免疫检测法制造技术

本发明专利技术揭示一种人类免疫缺陷病毒ＨＩＶ↓［１＋２］型抗体检测法－梳式斑点免疫法，采用人工合成多肽抗原（含ＨＩＶ－１型ｇｐ４１和ＨＩＶ－２型ｇｐ３６）吸附于梳状反应齿上，经与标本中存在的抗ＨＩＶ抗体反应后，抗原－抗体复合物与金标Ａ蛋白作用，抗体阳性的标本在梳齿与标本的接触端显示粉红色斑点，而阴性标本无任何颜色，本发明专利技术的测出法具有快速、简便、灵敏和特异性的优点，结果易于观察，并可永久保存。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人类免疫缺陷病毒HIV1+2型抗体检测法，具体是一种梳式斑点免疫检测法。国际上检出艾滋病的方法有多种如间接ELISA测定法、直接FIA测定法、免疫印迹法测定法、Biochrom测定法、IAF Biochem测定法、Pharmacia测定法等。其中以合成多肽作为艾滋病的诊断试剂，因其肽是通过纯化学法合成，不引入任何污染抗原，具有高特异性和高敏感性等优点，是很有发展前途的一种诊断试剂。95年美国Schwartz-DH等叙述各种商用HIV抗体诊断试剂盒对测试的血清样品，其HIV感染的检出是100％的灵敏，Murex Single应用诊断系统和UntiedBiomedical公司的HIV-1/2酶免疫测定(ELA)试剂盒检出HIV-1gp41的抗体的专一性达98～100％。94年西班牙Fernandez-Rodriguez-E等叙述使用快速诊断免疫酶测定(测试包为HIV1/HIV-2)，在唾液里检出HIV抗体，此法对静脉药物泛用的人群意义尤为重大。文献叙述了从70名艾滋病患者的血清和唾液里，均能用此法同时和预期测量抗-HIV抗体。国内中国专利技术专利CN 1052310是美国病毒技术公司在90年10月在中国申请的专利，文中叙述特异性肽片段HIVp17被用作检测和治疗艾滋病的诊断剂和疫苗。本专利技术的目的是提供一种梳式斑点免疫检测法，用于检测血清、血浆或全血的HIV1+2抗体。本专利技术的上述目的是通过以下方式实现的一种梳式斑点免疫检测法，包括将含HIV-1gp41和HIV-2gp36的人工合成多肽抗原色被于梳齿上，经与标本中存在的HIV反应形成抗原——抗体复合物，再与金标A蛋白作用，抗体阳性者梳齿尖即呈现红色斑点，阴性者无色。本专利技术的优点是明显的，本方法通过特殊的合成肽，减少了非特异性反应；采用金标代替酶标，大大缩短检测所需的时间；使用梳条代替酶标板，无需任何设备，结果易于判断并可永久存档，而且灵敏度高达100％，特异性为99.9％；时间短，在20分钟可获得检测结果，所以适于临床、基层血站和落后边缘地区推广使用；另外，它适于长期存放，置于37℃可达二周，22℃三个月，4℃一年灵敏度，特异性不受影响。本专利技术方法中采用的HIV-1gp41和HIV-2gp36合成抗原的纯度＞95％，溶解度≥1mg/ml，在浓度＜2μg/ml时有强的抗原性，HIV-1gp41和HIV-2gp36其序列分别为gp41Arg-Ile-leu-Ala-val-Glu-Arg-Tyr-leu-lys-Asp-Gla-Gln-lev-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-lys-lev-ile-Cys-NH2gp36AGln-Asp-Gln-Ala-Arg-leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary-Gln-Val-Cys-NH2。A蛋白是一分子量42KD的多肽，是金黄色葡萄球菌S.aureus的正常膜组份。抗体分子有两个A蛋白的结合位点，位于重链的第二和第三恒定区。但是由于来源于不同动物的抗体以及不同的抗体型和亚型之间，其FC片断不同，因此A蛋白与不同抗体的亲合能力也不相同。A蛋白与来源于人、免、鼠的抗体具有很强的亲合力。A蛋白与抗体FC片断的结合是通过疏水作用完成的，因此不会改变该抗体与抗原的结合活性。通过与酶、荧光素、胶体金等的结合，A蛋白可以用来对抗体进行定位或定量。本专利技术使用的A蛋白，每mg可结合10-11mg人IgG。并具有如下的质量指标外观肉眼观察为冰冻干燥粉未。光吸收在275nm光吸收，当10mg/mL浓度的A蛋白溶液A275≥1.32，样品光吸度(275nm)不低于此标准品的88％。光谱特性在250-350nm的光扫描图谱，其最大光吸收在275nm，最小光吸收在250nm，在267nm存在一个峰，在320nm的光吸收应小于0.04。纯度用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定为银染色单一条带(42KD)。以下将结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例梳式斑点免疫检测法一、试剂和包被梳的制备(1)点梳液的配制配方HIV-1gp41(购自美国BCI公司)0.1mgHIV-2-gp36(购自美国BCI公司)0.15mgNa2CO3(AR)0.6gNaHCO3(AR)0.29g用重蒸馏水稀释至100ml的溶液PH＝9.6，采用8μl/孔点于18齿塑料梳尖上，于4℃过夜。(2)封闭液的配制配方NaCl(AR)1.7g 0.2MNa2HPO47.7ml0.2M NaH2PO42.3ml蔗糖(AR)10gBSA(购自美国Sigma公司)0.2g用重蒸馏水稀释成200ml的溶液pH＝7.4，采用10μl/孔封闭上述(1)梳点，于37℃二小时，干燥真空包装后备用。(3)显示剂的配制配方1％氯化金60ml1％柠檬酸钠240ml加重蒸馏水至5000ml后，加热煮沸15分钟，冷却至30℃，再加入A蛋白(购自美国BCI公司)9mg5％BSA(购自美国Sigma公司)1g于12000转/分离心60分钟，弃上清液，沉淀中加入乙二醇(AR)20mlNaN3(购自美国Sigma公司)1g用0.01M PBS(AR)稀释至2000ml(λ＝525nm 0D＝0.35)。(4)样品稀释液配制配方0.2M Na2HPO428ml0.2M NaH2PO472mlNaCl(AR)17gNaN3(购自美国Sigma公司)0.48BSA(购自美国Sigma公司)0.2gTween-20(购自美国Sigma公司)1ml用重蒸馏水稀释至2000ml(5)抗HIV1+2阳性对照配制配方HIV1+2阳性血清(购自美国BCI公司)80mlNaN3(购自美国Sigma公司)0.1g将其混匀后使用。(6)抗HIV1+2阴性对照配制配方HIV1+2阴性血清(购自美国BCI公司)80mlNaN3(购自美Sigma公司)0.1g将其混匀后使用。(7)洗涤液配制配方NaCl(AR)170gNaN3(购自美国Sigma公司)4g0.2Mna2HPO4770ml0.2MNaH2PO4230mlTween-20 20ml加重蒸馏水至20000ml pH＝7.4。二、检测方法(1)标记待检样品和检测梳的编号、位置和日期。(2)在微孔反应板的每一标孔内加上述样品稀释液1滴，再分别加入待检样品或上述抗HIV1+2阳性和阴性的对照品1滴(50μl，充分混匀。(3)将检测流插入相应的标本行中，室温孵育10分钟。(4)在微孔反应板的第二排孔内，每孔加入上述显示剂3滴。(5)在洗涤槽中加入由20ml加80ml重蒸馏水的上述洗涤液。(6)将孵育完毕的梳子取出，把齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。(7)将梳齿插入稀释好的洗涤液中，来回摆动10次，然后将齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。(8)将梳齿插入上述显示剂中，室温孵育10分钟，重复(6)～(8)，将检测梳标记面向上放在吸水纸上晾干。(9)在强光或日光下与眼平齐、垂直观察结果，梳尖具有粉红色圆点均为阳性(即使是很浅的粉红色圆点，没有颜色为阴性。(10)将梳子装入档案夹内存档备查。采用本方法检测血清、血浆或全血的HIV1+2抗体的灵敏度高达100％，特异性为99.9％，操作简单，无需反复洗涤，操作时间短，仅需20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梳式斑点免疫检测法，其特征包括将含ＨＩＶ－１ｇｐ４１和ＨＩＶ－２ｇｐ３６人工合成多肽抗原包被于梳齿上，梳齿与标本中存在的ＨＩＶ反应，再与金标Ａ蛋白作用，以梳齿显示或不显示粉红色点进行判别，有粉红色圆点为阳性，没有颜色者为阴性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱绍荣，
申请(专利权)人：上海荣盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]