一种检测生物样品中靶核酸序列的方法，包括以下步骤： ａ）从生物样品中获得核酸分子； ｂ）将核酸分子固定到一固相支持物上，产生一固定化的核酸分子； ｃ）将一检测寡聚核苷酸与固定化的核酸分子杂交并除去未杂交的检测寡聚核苷酸； ｄ）将步骤ｃ）的产物离子化并挥发；和 ｅ）用质谱对检测寡聚核苷酸进行检测，其中检测到检测寡聚核苷酸表明生物样品中靶核酸序列的存在。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
所有活的有机体(如动物、植物和微生物)的遗传信息均编码于脱氧核糖核酸(DNA)。在人类，完整的基因组含有约100,000个基因，位于24条染色体上(《人类基因组》，T.Strachan著，BIOS科技出版社1992年出版)。每一个基因编码一个特异的蛋白，这个蛋白质通过转录和翻译表达后，在活细胞中行使特定的生化功能。DNA序列的变化，如突变，会产生活性改变或在某些情况下失去了生化活性的蛋白，这将会导致遗传性疾病。突变包括核苷酸缺失、插入或改变(即点突变)。点突变可能是“错义的”，导致蛋白质氨基酸序列的改变，或是无义的，编码一个终止密码子，结果导致一个截断的蛋白质。目前已知超过3000种遗传性疾病(《人基因组突变》，D.N.Cooper和M.Krawczak著，BIOS出版社1993年版)，包括血友病、地中海贫血症、假肥大性肌营养不良(DMD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、早老性痴呆和囊性纤维变(CF)。除了导致遗传病的突变基因外，一些生殖缺陷是染色体异常如21三体(唐氏综合症)、13三体(Patau综合症)、18三体(爱德华综合症)、X单体(特纳综合症)和其它性染色体非整倍体如克莱恩费尔特综合症(XXY)的结果。另外，有越来越多的证据表明一些DNA序列能诱导个体产生下述的任何疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、多种自身免疫疾病和癌症(如直肠、乳腺、卵巢、肺部癌症)。病毒、细菌、真菌和其它感染性有机体含有特异的核酸序列，它们与宿主细胞的序列不同。因此，感染性有机体可根据其特异的DNA序列被检出并鉴别。既然16核苷酸的序列甚至对人类基因组的大小在统计范围内是特异的，那么相对短一些的核酸序列可用于检测较高等生物正常和有缺陷的基因并检测感染性微生物(如细菌、真菌、原生生物和酵母)和病毒。DNA序列甚至可作为指纹检测同一物种的不同个体(Thompson，J.S.和M.W.Thompson编《医学遗传学》，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA(1986))。许多检测DNA的方法目前已被应用。例如，用凝胶电泳法通过比较一个扩增的核酸片段与已知的标准的迁移率来鉴定核酸序列，或者用与被检测序列互补的探针杂交来鉴定。但是，只有在核酸片段用敏感的报道官能团(如放射性(32P、35S)、萤光或化学发光)标记后才能实施鉴定。然而，放射性标记是危险的而且它们产生的信号随时间衰减。非同位素标记(如萤光)则灵敏度不够而且当用到高强度激光时信号衰减。另外，标记、电泳和随后的检测是费力、耗时而且易出错的方法。电泳尤其易出错，因为核酸的大小或分子量与其在胶中的迁移率没有直接的关系。已知序列特异性效应，二级结构和与胶质的相互作用都能引起人为假象。通常，质谱通过分子在真空中离子化并使它们汽化飞起来提供一种给单个分子“称重”的方法。在电场和磁场的联合影响下，离子依其质量(m)和电荷(z)留下飞行轨迹。在低分子量的分子中，质谱长期以来就是通过确定母体分子离子的质量来分析和鉴定有机分子的常用的物理-有机方法。另外，通过母体分子离子与其它粒子(如氩原子)的碰撞，该分子离子以称作碰撞诱导裂解(CID)的方式片段化形成二次离子。片段化的方式/途径通常能推导出详细的结构信息。质谱法的许多应用在本领域，尤其在生命科学领域已为人熟知，并总结于《酶学方法》193卷“质谱”(J.A.McCloskey编)，1990年Academic Press，New York。由于质谱在提供高检测灵敏度、质量测量的精确性，由CID与质谱-质谱联用结合所提供的详细结构信息和分析速度，以及直接将数据输入计算机等方面具有明显的分析优势，人们已对将质谱用于核酸的结构分析产生深厚的兴趣。最近总结这方面的综述包括K.H.Schram，《核酸成份的质谱、质谱在生物医学中的应用》(Mass Spectrometry ofNucleic Acid Components，Biomedical Applications of MassSpectrometry)1990年34卷203-287页；和P.F.Crain“核酸研究中的质谱技术(Mass Spectrometric Techniques in NucleicAcid Research)”，《质谱述评》，1990年9卷505-554页。然而，核酸是非常极性化的生物多聚体，非常难以汽化。因而，质谱检测仅限于低分子量的合成的寡聚核苷酸，通过检测母体分子离子的质量并通过它来证实已知的寡聚核苷酸序列，或者用另一种方法，利用CID与质谱-质谱联用结合，特别是用来产生离子化和气化的快速原子轰击方法(FAB质谱)或等离子解吸方法(PD质谱)产生的二级离子(片段离子)来证实已知序列。例如，FAB对化学合成寡聚脱氧核苷酸的保护二聚体的分析的应用已详述(Kster等《生物医学环境中的质谱》，1987年14卷111-116页)。两种较新的离子化/解吸附技术是电喷雾/离子喷雾(ES)和基质辅助激光解吸附/离子化(MALDI)。ES质谱已由Fenn等介绍(《物理化学杂志》(J.Phys.Chem.)1984年88卷4451-59页；PCT申请No.Wo90/14148)。目前的应用总结于最近的综述文章(R.D.Smith等，《分析化学》(Anal.Chem.)1990年62卷882-89页和B.Ardrey，“电子喷射质谱(Electrospray Mass Spectrometry)”，《欧洲谱学》(Spectroscopy Europe，1992年4卷10-18页)。一个40核苷酸(Covey等，“利用离子喷雾质谱确定蛋白质、寡聚核苷酸和多肽的分子量(Determination of Protein Oligonucleotide and PeptideMolecular Weights by Ionspray Mass Spectrometry)；《质谱快讯》(Rapid Communications in Mass Spectrometry)，1988年2卷249-256页)和一个21核苷酸(《酶学方法》(Methods inEnzymology)193卷，《质谱》(Mass Spectrometry)”，McCloskey编，425页，1990，Academic Press，New York)的分子量已发表。作为一个质量分析器，四极杆(quadrupole)最常用到。飞摩尔量级样品中分子量的确定是非常精确的，因为有许多离子峰存在，而它们均能用于质量计算。与四极杆相比，当飞行时间(TOF)配置被用作质量分析器时，MALDI质谱术则更具吸引力。MALDI-TOF质谱术已由Hillenkamp等介绍(“基质辅助紫外激光解吸附/离子化生物大分子质谱的新方法(Matrix-Assisted UV-Laser Desorption/IonizationA NewApproach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules)”，《生物学质谱》(Biological Mass Spectrometry)(Burlingame和McCloskey编)，Elsevier Science Pub本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：H·克斯特尔，G·S·希金斯，K·坦格，A·布劳恩，D·J·富，B·达尔奥弗·德马尔，C·W·西格伊尔特，C·朱林凯，D·P·利特尔，
申请(专利权)人：西昆诺姆有限公司，
类型：发明
国别省市：
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