一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物及其水凝胶的制备方法技术

一种pH敏感型PCA‑g‑CMCS聚合物及其水凝胶的制备方法，属于复合材料技术领域。步骤：1)采用EDC/NHS化学交联法，通过调节反应体系pH值和原料的投料摩尔比等工艺条件，优化提高PCA的接枝率；2)与CMCS相比，PCA‑g‑CMCS的水溶性下降，保留来自CMCS的pH值敏感性，且在pH≤5.75和pH≥7.25时，光学透射率接近100％，pH在5.75‑7.25时呈絮凝状态；3)通过冷冻干燥和EDC/NHS交联固化的方法制备PCA‑g‑CMCS多孔水凝胶支架，与CMCS支架相比，PCA的接枝降低改性支架的吸水率和体外降解速率，提高压缩模量，且DPPH和ABTS自由基清除能力分别提高7.5倍和5.9倍，能在15天内保持PCA的体外释放活性。本方法工艺简单，具有较好的重复性，有效提高PCA的接枝效率，获得的pH敏感型水凝胶性能优良，具有明显的神经保护作用，为抗氧化药物控制释放和神经组织工程等潜在应用提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物及其水凝胶的制备方法
本专利技术涉及复合材料
，具体涉及一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物及其水凝胶的制备方法。
技术介绍
壳聚糖(chitosan,CS)及其水溶性衍生物羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan,CMCS)具有许多独特的生理特性，如生物降解性、抗氧化性、无免疫原性、抗菌性和良好的生物相容性等，这使得它们在食品、组织工程、制药和化妆品行业等有广泛的应用。CS和CMCS主链上携带有-OH，-NH2和-COOH活性基团，有助于对这些材料的化学改性，从而赋予一些新功能(如抗氧化、抗炎症和导电性等)。目前多种形式的CS基新材料，包括膜、纳米纤维、微/纳米颗粒和水凝胶等，已被广泛应用于组织修复与再生的生物医学工程领域。然而，由于CS本身在生理pH(>6.0)下溶解度较低，限制了其在对溶解度和释药速率要求较高的体系中的应用。幸运的是，CS中存在活性氨基(C-2)，伯羟基(C-3)和仲羟基(C-6)有助于化学修饰，从而增强其固有性质或提供一些新的性质。CMCS是通过部分羧甲基化CS链上的羟基或氨基而获得。羧甲基的引入提高了CS的水溶性，并且羧甲基官能团可以和其他材料的氨基和羟基化学接枝，从而赋予CMCS更多新的功能。研究表明，CMCS具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，在伤口愈合、组织工程、药物/酶递送和化妆品等各个领域都有突出的应用。因此，CMCS除了保留CS的良好生物相容性之外，还表现出改善的水溶性、成凝胶能力、pH值敏感和生物活性(如抗氧化活性和过渡金属螯合活性)等。而且，近期研究显示CMCS还具有引导神经再生、防止组织黏连、促进伤口愈合、减少瘢痕形成等优点，这使得CMCS可望成为一种有前途的生物医学材料，用于药物输送和组织工程移植。但CMCS水凝胶的吸水能力过强且质脆易碎，一般来说很难在临床医学领域得到大规模的应用。然而CMCS作为一种两性聚电解质聚合物，主链上-OH，-NH2和-COOH基团的存在同样使得易于对其进行化学改性。因此，通过接枝共聚反应接枝引入其他抗氧化组分，使CS和CMCS具有更强的抗氧化活性是CS基改性材料研发的常用策略之一。近年来已有文献报道将没食子酸(GA)、蚕丝肽和胶原肽等抗氧化物质化学接枝到CMCS上，显著提高了CMCS的体外抗氧化活性。可以预见，基于CMCS的改性抗氧化复合材料更有希望成为组织工程治疗神经退行性疾病(neurodegenerativediseases,ND)和创伤性脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)等的良好支架材料。植物多酚(polyphenols)是一类存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物，其来源广泛、种类繁多。它们的酚羟基易于通过捕获自由基(例如活性氧)而氧化成醌结构，这使得多酚具有较强的抗氧化性和清除自由基能力。研究表明，某些多酚在神经元细胞死亡或神经变性的体外内模型中均显示出良好的神经保护活性，是一类潜在的神经保护药物。在过去十年中，使用多酚来治疗ND，尤其是AD已有很大的发展，显示多酚类抗氧化剂在神经保护和修复氧化损伤过程中似乎是非常有价值的潜在药物。原儿茶酸(protocatechuicacid,PCA)，又名3，4-二羟基苯甲酸，是一种酚酸类单体抗氧化剂，能有效地抑制脂质过氧化，对多种自由基均有良好的清除活性，并具有明显的抗炎和抗菌等作用。PCA可保护H2O2诱导损伤的PC12细胞，避免氧化应激引起的神经毒性，在神经干/祖细胞的增殖和神经保护中起关键作用，可以诱导神经元成熟并有效促进神经突生长。此外PCA还可作为PD和AD等疾病治疗的有效神经保护剂。然而PCA等酚酸类单体作为小分子抗氧化剂的稳定性较差，体内代谢周期短，生物利用度低，难以长效发挥其抗氧化保护作用。例如，在小鼠血浆中，当浓度为0.5μg/mL和5.0μg/mL时，PCA被迅速降解，半衰期分别为90min和314min。因此，通过物理或者化学方法将小分子抗氧化物质(如酚酸类)接枝引入具有良好生物相容性的可生物降解材料中，开发具有稳定和持久抗氧化能力的复合水凝胶支架，提高其生物利用度，以应对神经修复过程中氧化应激的持续损伤，可能是治疗ND和TBI等相关疾病的潜在方法之一。目前，实现酚酸接枝CS(酚酸-g-CS)的方法主要有三种：酶催化法、自由基聚合法和碳二亚胺法。酶催化接枝方法具有以下优点：第一，酶的高选择性和专一性，省去了化学偶联反应中涉及的保护和去保护步骤；第二，酶催化接枝法比化学偶联方法更安全和环保。但是，酶催化接枝法也有一些局限性。例如，酶可能会催化酚酸上的酚羟基氧化为邻醌，这最终会降低其生物活性，如接枝产物的抗氧化和抗菌活性等。近年来，硝酸铈铵、过硫酸钾和H2O2/Vc氧化还原对等自由基引发体系被用来合成酚酸-g-CS。在这些体系中，H2O2/Vc氧化还原对应用最为广泛。它具有如下几个优点：首先，产生自由基的接枝试剂(如H2O2/Vc)比碳二亚胺和酶的价格较低；其次，室温反应可以避免酚类的降解和氧化；最后，H2O2/Vc氧化还原对的毒性相对要小于碳二亚胺试剂，这尤其适合于药物开发。这些优点使得基于H2O2/Vc反应体系开发的酚酸-g-CS材料在生物医学领域得到了较多的应用。然而自由基介导的接枝方法也有一定的局限性，主要是·OH自由基在聚合过程中进攻CS分子，导致CS分子链断裂，造成CS分子量降低。通常，自由基聚合法获得的酚酸-g-CS的分子量会小于碳二亚胺法和酶催化法，这不利于进一步开发具有一定机械强度的3D支架。已报道采用绿色环保的H2O2/Vc氧化还原对介导的自由基反应可将PCA接枝到CS上，合成水溶性的PCA-g-CS聚合物，但该方法不适用于获得成形的三维水凝胶支架。研究显示，碳二亚胺交联体系则不会出现这种问题，碳二亚胺化学偶联剂如EDC和DCC已被广泛用于酚酸-g-CS的合成。与酶催化接枝法和自由基介导法相比，碳二亚胺交联体系具有最高的接枝效率，并且只需要温和的反应条件。接枝反应通常在酸性水溶液中进行，大大改善了CS反应底物的溶解度。此外，偶联试剂和副产物均为水溶性，可以通过透析除去。迄今为止，已成功通过这种方法将各种酚酸接枝到CS骨架上。例如，Liu等通过碳二亚胺介导的交联反应获得了PCA-g-CS，接枝聚合物的还原能力和DDPH自由基清除活性远高于CS。将聚合物制备成薄膜后，发现PCA-g-CS膜对DPPH自由基清除活性呈剂量依赖性和时间依赖性，有望用作新型抗氧化剂食品包装材料。Yu等合成了GA-g-CMCS，发现该材料对DPPH和ABTS自由基的清除活性呈剂量依赖性。Eom等比较了八种不同酚酸-g-寡聚糖(对羟基苯甲酸、香豆酸、PCA、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、丁香酸和芥子酸)的抗氧化活性(DPPH、·OH和·NO自由基清除能力和还原能力)，发现PCA-g-寡聚糖和咖啡酸-g-寡聚糖具有比其他酚酸-g-寡聚糖更高的抗氧化活性。除了研究酚酸-g-CS水溶液的性质之外，研究者也尝试开发具有3D结构的抗氧化酚酸-g-CS复合材料。例如，Kang等合成了聚(甲基丙烯酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物的制备方法，其特征在于，所述pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物为原儿茶酸接枝的羧甲基壳聚糖聚合物材料，简写为PCA-g-CMCS，具有稳定抗氧化成分释放的能力；制备方法包括如下步骤：/nS1、将羧甲基壳聚糖CMCS溶于2-吗啉乙烷磺酸MES缓冲溶液或磷酸盐PB缓冲溶液中，室温下搅拌8～12h，得到CMCS溶液；/nS2、将原儿茶酸PCA溶于n,n-二甲基甲酰胺DMF溶液中，得到溶液A；将交联体系溶于MES缓冲溶液中，得到溶液B，交联体系包括碳二亚胺EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS；将溶液A与溶液B按1:9的体积比混合得到混合液，其中，每3mL混合液对应加入0.2～0.6mmol PCA；所述PCA和交联体系的摩尔比为1：0.5～3；将混合液置于冰水浴下避光搅拌1h，以活化羧基，得到激活液；/nS3、将步骤S2得到的激活液加入到步骤S1制备的CMCS溶液中，用1M HCl或1M NaOH分别调节反应液pH至5.0～6.0或者7.0～7.5；所述激活液与CMCS溶液的体积比为3：10；/nS4、室温下避光搅拌24h后，采用0.1M HCl调节反应液pH至4.5～5.5，随后倒入无水乙醇析出沉淀；/nS5、高速离心分离后，将沉淀分别用乙醇、无水乙醇和石油醚洗涤，直到高效液相色谱HPLC未检测到游离PCA；/nS6、真空干燥后，获得pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物粉末，避光储存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物的制备方法，其特征在于，所述pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物为原儿茶酸接枝的羧甲基壳聚糖聚合物材料，简写为PCA-g-CMCS，具有稳定抗氧化成分释放的能力；制备方法包括如下步骤：
S1、将羧甲基壳聚糖CMCS溶于2-吗啉乙烷磺酸MES缓冲溶液或磷酸盐PB缓冲溶液中，室温下搅拌8～12h，得到CMCS溶液；
S2、将原儿茶酸PCA溶于n,n-二甲基甲酰胺DMF溶液中，得到溶液A；将交联体系溶于MES缓冲溶液中，得到溶液B，交联体系包括碳二亚胺EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS；将溶液A与溶液B按1:9的体积比混合得到混合液，其中，每3mL混合液对应加入0.2～0.6mmolPCA；所述PCA和交联体系的摩尔比为1：0.5～3；将混合液置于冰水浴下避光搅拌1h，以活化羧基，得到激活液；
S3、将步骤S2得到的激活液加入到步骤S1制备的CMCS溶液中，用1MHCl或1MNaOH分别调节反应液pH至5.0～6.0或者7.0～7.5；所述激活液与CMCS溶液的体积比为3：10；
S4、室温下避光搅拌24h后，采用0.1MHCl调节反应液pH至4.5～5.5，随后倒入无水乙醇析出沉淀；
S5、高速离心分离后，将沉淀分别用乙醇、无水乙醇和石油醚洗涤，直到高效液相色谱HPLC未检测到游离PCA；
S6、真空干燥后，获得pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物粉末，避光储存。


2.根据权利要求1所述的一种pH敏感型PCA-g-CMCS聚合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述每10mLMES缓冲溶液对应加入0.2mmolCMCS，其中，MES缓冲溶液的浓度为100mM，pH＝5.5；当整个反应体系pH7.4时采用PB缓冲溶液，同样所述每10mLPB缓冲溶液对应加入0.2mmolCMCS。

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【专利技术属性】
技术研发人员：关水，孙长凯，徐超，许建强，徐卫平，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21