新的肽制造技术

本发明专利技术提供诱导生长激素分泌的新的肽类化合物。肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有提高细胞内钙离子浓度的活性，至少一个氨基酸被修饰氨基酸和／或非氨基酸化合物替代。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以肽中的氨基酸被修饰为特征的，具有提高细胞内钙离子浓度作用或生长激素分泌诱导活性的新的肽。另外，本专利技术还涉及该新肽的获取方法和制造方法，编码该肽和该肽前体的遗传因子，以及使用该遗传因子的该肽和该肽前体的制造方法。进一步，涉及本专利技术公开的新修饰肽的结构类似物，具有与生长激素诱导化合物的受体结合提高细胞内钙离子浓度的作用或生长激素分泌诱导活性的肽类似物及其制备方法。本专利技术还涉及含有该肽或该肽类似物作为有效成分的药物组成物，动物生长促进剂，或该肽的抗体或其利用方法。自从人GH可通过基因重组技术生产以来，GH不仅用于上述侏儒的治疗，在其它疾病的治疗中也被使用，并可看到各种效果。例如，具有在正常人中活性成骨细胞和骨的再构成，在GH缺乏症成人中增强肌肉量和肌肉力量，提高GH缺乏症成人的运动能力，治疗小儿重度烧伤、在诱发排卵中与促性腺激素并用，预防强的松给药引起的蛋白质代谢异常，促进重度免疫缺损症中的T细胞“教育”，抑制老年性体重减少，脂肪组织扩大和皮肤萎缩的效果等。在促进小儿生长，以及使缺乏GH的成人中伴随的代谢或功能缺损正常化中，使用重组GH给药是有效的，但是存在限定用量的副作用，以及不能口服和费用方面的问题。很多成人患者，由于过剩的钠和体液贮留引起的关节痛或手根管综合征等副作用，不能继续GH给药。这些副作用与GH给药引起的非生理方式的激素分泌相关，用GH给药不能模仿正常GH分泌的脉动性。生物体内GH分泌的脉动性，一般通过下丘脑由来的2种控制因子相互作用来确立的，即，GHRH与生长抑素对下垂体的作用，控制GH的分泌。正常的GH分泌形式是昼夜不同，在夜间更频繁地释放出更多的GH。GH释放的脉冲振幅，通过各种甾类激素、神经传导物质、GH和胰岛素样生长因子引起的反馈，营养状态，睡眠和运动进一步被调节。为克服上述GH给药中伴随的副作用，合成了大量具有GH分泌诱导活性的化合物，作为GH分泌诱导物质(GHS；growth hormonesecretagogue)，集中精力研究了其构效关系、药理学、临床应用等。首先，合成了GHRP-6(Growth Hormone-Releasing hexapeptide)等肽，作为GH欠缺至低下引起的疾病的治疗药被开发。但是，这些肽化合物只有静脉注射才能发挥效果，因此开发了可口服给药的低分子量非肽类化合物，并进行到第二期临床试验阶段。在细胞中，将从受体接收信号到表达功能的一连串情报的传导称为信号传导(signal transduction)，与G蛋白质共轭的信号传导按照如下的机理进行。该G蛋白质共轭体系分为具有细胞膜7次贯通性受体的，产生作为第二信使的cAMP的cAMP体系和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)或二酰基甘油(DG)肌醇磷脂情报传导体系。cAMP活化cAMP依赖性激酶(A激酶)，引起功能蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，修饰活性。另一方面，IP3与小胞体上的IP3受体结合，促进钙离子的游离，DG促进C激酶的活化，激素等作用的表达。在IP3或DG成为第二信使的信号传导体系中，提高细胞内钙离子浓度的机理如下所述。配位体一旦与受体结合，通过G蛋白磷脂酶C被活化，从PIP2生成IP3。IP3将贮存于作为细胞内颗粒的ER等小胞体中的钙离子释放到细胞质中，提高细胞质中的钙离子浓度。IP3或钙离子如果进一步存在于细胞质中，钙离子再次被小胞体摄取，细胞质中的钙离子浓度降低。即，配位体与受体的结合，可一次性提高细胞质中钙离子浓度。GHS协同作用于GHRH引起的GH分泌和细胞内cAMP水平的提高、且GHRH与受体的结合相对于作为第二信使的cAMP的产生，GHS使得细胞内钙离子浓度升高，由此暗示GHS的作用机理与GHRH不同，假定为GHS结合的受体不同于GHRH结合的GHRH受体。实际上，从GHS结合的受体基因克隆，Northern印迹分析的结果显示GHS受体(GHS-R)在下丘脑和下垂体表达，且从猪和人的GHS-R的氨基酸序列显示90％以上的同一性。但是，与GHS-R结合的内在性配位体不能分离出来，该GHS-R是配位体为不明确的孤儿受体。在蛋白质的氨基末端或构成蛋白质的氨基酸残基侧链中，键合了肉豆蔻酸、香叶基酸(ゲラニル酸)、棕榈酰基酸(パルミトイル酸)、或法呢基酸(フアルネシル酸)等脂肪酸，这些脂肪酸的任务是将这些脂肪酸修饰的蛋白质锚合(anchoring)到细胞膜上。在这些脂肪酸修饰的蛋白质中，脂肪酸与半胱氨酸残基通过S-酰基键结合，如本专利技术公开的内在性GHS那样的通过O-酰基与丝氨酸残基结合了脂肪酸的氨基酸、含有该脂肪酸修饰的氨基酸的蛋白质和肽是完全未知的。另外，含有脂肪酸修饰的氨基酸的肽，也不知道其作为受体的配位体的功能。在详细说明本专利技术之前，先定义以下用语。肽是指，多个氨基酸通过肽键连接的化合物。这里氨基酸(或氨基酸残基)是指，在氨基酸的通式NH2-CH(R′)-COOH中，R′是具有天然存在取代基的天然氨基酸，并包括它的D，L-光学异构体。天然氨基酸也会被修饰的氨基酸(或修饰的氨基酸残基)替代。修饰的氨基酸是指，上述通式中的取代基R′进一步被修饰的氨基酸，并包括其D，L-光学异构体，还包括例如上述通式中的取代基R′中，通过或不通过酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲或硫脲等，键合了各种取代基的非天然氨基酸。另外，还包括氨基酸的氨基上被低级烷基取代的非天然氨基酸。肽类似物是指，肽中至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代的化合物，因此，该替代化合物的肽类似物中至少一个键不是肽键。另外，将这些肽和肽类似物的氨基末端和/或羧基末端被修饰的化合物作为衍生物，将肽、肽类似物和这些衍生物总称为肽类化合物。在SEQ ID NO.2记载的氨基酸序列中，至少从氨基末端第4至第10的氨基酸序列是如下所示序列。Gly Ser Ser Phe、Gly Ser Ser Phe Leu、Gly Ser Ser Phe Leu Ser、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His、或、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln。人们需要与GHS受体结合提高细胞内钙离子浓度，或具有诱导GH分泌活性的内在性配位体，即内在性GHS表达和利用方法。另外，还需要在该内在性GHS的结构类似物中，可提高细胞内钙离子浓度或具有GH分泌诱导活性的化合物。另外，还需要含有该内在性GHS或其结构类似化合物，可通过诱导GH脉动分泌，无GH给药副作用的药物组合物或促进动物生长的组合物，以及使用该组合物的治疗方法。本专利技术的专利技术者，着眼于配位体与GHS受体(GHS-R)结合可以将肌醇磷脂作为第二信使一次性提高细胞内钙离子浓度，将表达GHS-R的CHO细胞(CHO-GHSR62)中提高细胞内钙离子浓度的活性(Ca提高活性)作为指标，筛选各种脏器或组织萃取物。结果发现，大鼠胃萃取物具有强的Ca提高活性，从该萃取物用各种色谱纯化得到具有Ca提高活性的物质，发现该物质是脂肪酸修饰的分子量约3,000的新的肽。另外，确认该新肽可促进垂体前叶细胞的GH特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述肽是具有提高细胞内钙离子浓度活性的肽，其至少一个氨基酸被修饰氨基酸和／或非氨基酸化合物替代。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：寒川贤治，儿岛将康，细田洋司，松尾寿之，南竹义春，
申请(专利权)人：寒川贤治，
类型：发明
国别省市：JP[日本]