传染性病原体相关蛋黄抗体的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种传染性病原体相关蛋黄抗体的制备方法，包括针对于病原体免疫原的蛋黄多克隆抗体ＩｇＹ、抗独特型抗体和病原体特异性表达抗原的制备方法，另外还涉及该蛋黄抗体的用途。本发明专利技术主要以产蛋禽类尤其是鸡作为免疫反应器，用一种或多种病原体免疫原进行免疫注射，特点是多种免疫原单独或多种联合进行禽类尤其是鸡的免疫注射，其产蛋中即有针对于上述病原体免疫原的多克隆抗体ＩｇＹ或抗独特型抗体或病原体特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存。本发明专利技术具有成本低、产量高、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点，尤其是能避免ＨＡＭＡ反应和异质性问题，且无毒副作用、安全性好。适用于传染病的免疫诊断、治疗和预防，尤其适用于对人类具有极大危害性传染病如艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、结核、幽门螺杆菌性胃炎、梅毒、淋病等性传播性疾病、病毒性肠炎及流感等疾病的主、被动免疫治疗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是涉及传染性病原体相关蛋黄抗体的制备方法，另外还涉及该蛋黄抗体的用途。上述单克隆抗体(简称单抗)或多单克隆抗体(简称多抗)作为传染性疾病的诊断剂或检测剂，近年来已在医学和生物学领域得到广泛应用。该类方法的原理是基于单抗或多抗对相应传染性疾病病原体相关抗原的高特异性识别能力而设计的，结合以相应的标记物(酶标、金标、硒标、荧光、发光和放射性标记等)而显示传染性疾病病原体相关抗原的存在与否及其量的多少。单抗作为治疗剂的研究也于近年获得重要进展。单抗药物(monoclonal antibody agents)可应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用于传染性疾病的治疗，已显示出良好的前景。抗体药物一般包括两类，一是抗病原体单抗或多抗；二是抗病原体单抗或多抗偶联物，或称免疫偶联物(1mmunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗或多抗与“弹头”药物两部分构成，故称为导向药物，又称为生物导弹或“魔弹”(magic bullets)，与之相对应的治疗方法称为导向治疗。单抗或多抗所针对的靶标通常为病原体表面的相关抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素，其与单抗或多抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自80年代以来对抗病原体尤其是抗肿瘤单抗药物进行了大量研究，特别是自1997年以来，Rituxan、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗，单抗药物的研究与开发有了新的发展势头，成为生物技术药物的新热点(甄永苏，单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望，中国医学科学院学报，2000，229-12)。尽管单抗药物的临床研究结果已为其应用于治疗肿瘤展示出良好的前景，但仍有许多问题需要进一步研究解决(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituximab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disordersevaluation of response on 48 patients.Eur J Haematol，1999，6276-82)。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面的问题关键是人抗鼠Ig抗体(HAMA)反应，因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备，往往导致HAMA反应。此外，病原体在抗原性方面的异质性，病原体的抗原性调变等也能影响单抗药物的疗效。药理学方面的问题主要是到达病原体的药量不足。单抗药物在体内运送过程中受多种因素影响。由于它是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、牌和骨髓；再者就是机体对该异体蛋白产生抗体而降低其效力。单抗药物是大分子物质，通过毛细血管内皮层以及穿透病原体均受到限制。(甄永苏，单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望，中国医学科学院学报，2000，229-12)。传染性疾病免疫治疗是利用病原体抗原进行主动免疫来激发、增强机体对病原体的主动特异性免疫反应。目前所研究的病原体疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗。其中a病原体基因工程疫苗是通过基因重组技术，将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗。b肽疫苗是基于在免疫反应中抗原在胞浆内降解为短肽，最后形成肽-MHC-TCR复合体最终激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。c核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的抗原基因片段和载体构建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究较多的为DNA疫苗。核酸疫苗能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，诱导许多亚单位疫苗不能诱导的CTL效应。d抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)是根据抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用，同时能克服机体免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原体抗原诱发特异性主动免疫反应(Bhattacharya CM，Mukerjee S，biddle W，et alMurine monoclonal anti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonicantigen.J Immumol，1990，1452758)。在上述病原体疫苗免疫治疗方法中，由于病原体抗原的抗原性强弱不同，且病原体宿主经常处于免疫抑制状态，难以激发有效的抗病原体反应。尽管抗独特型抗体的研究已取得许多进展，但事物总是两方面的。Ab2疫苗应用存在许多困难，因为Ab2β虽能模拟小分子多肽抗原，却难以精确反映大分子蛋白质抗原的决定簇，尤其是Ab2β单抗。再者由于病原体抗原极其复杂，常发生调变等，制备广谱的病原体特异性独特型疫苗难度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要来自鼠杂交瘤细胞，为异种蛋白，能激发人免疫系统产生人抗鼠Ig抗体(HAMA)，发生中和反应并产生毒性免疫复合物，而降低疗效，严重时可引起血清病反应。鉴于以上技术方案所存在的诸多问题，为了避免或减少HAMA反应，现通常是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。单抗人源化主要是通过基因工程技术制备嵌合抗体(chimericantibody)或改形抗体(reshaping antibody)。嵌合抗体是将Fc段置换为人源性，其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外，其它部分均为人源性。使偶联物分子小型化，以提高药物对病原体的渗透力，研制高效单抗药物。局部注射以提高单抗药物在病原体部位的浓度。多种抗体混合应用以弥补单抗的异质性问题。其中鼠源性单抗人源化和研制完全的人源抗体具有较高的技术难度，难于普及应用。禽类尤其是鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异，鸡的免疫球蛋白与哺乳动物免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体。鸡免疫系统针对于外源性蛋白所产生的IgY不仅具有更高的免疫特异性，更重要的是这种特异性IgY主要储存在鸡蛋黄中，因此可利用下蛋母鸡作为免疫反应器来大量生产具有重要临床应用价值的抗体药物。众所周知鸡蛋作为人类的常用食品和化妆品原料，无论内服和外用均对人体无任何生物毒性和不良作片。因此，利用禽类作为免疫反应器来大量生产抗体药物，并应用于传染性疾病的诊断和免疫治疗，将具有极广阔的应用前景。以传染性病原体相关蛋黄抗体IgY为原料制备的免疫药物和抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解决上述单抗偶联物或上述病原体疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题。专利技术目的本专利技术的目的在于克服上述缺点与不足，提供一种传染性病原体相关蛋黄抗体的制备方法，包括针对于病原体的蛋黄多克隆抗体IgY、抗独特型抗体和病原体特异性表达抗原的制备方法，尤其是针对与多重病原体的蛋黄多克隆抗体IgY、抗独特型抗体和病原体特异性表达抗原中的多重组合物的制备方法，另外还涉及该蛋黄抗体的用途即采用该蛋黄抗体制备相关药物、食品或保健品。技术方案本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性病原体相关蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：以产蛋禽类尤其是鸡作为免疫反应器，用一种或多种纯化的或采用基因工程技术重组的病原体特异性抗原或疫苗瘤苗或病原体特异性ＤＮＡ或ｍＲＮＡ及其与之相应载体组成的重组体或针对于病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体或病原体或上述病原体免疫原的脂质体复合物作为免疫原，分别单独进行或多种联合进行禽类尤其是鸡的多次重复免疫注射，然后再以不完全佐剂进行追加强化反应，待５－２０天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述病原体免疫原的多克隆抗体ＩｇＹ或抗独特型抗体或病原体特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存。其具体步骤包括：ａ）病原体免疫原或其组合物进行多次免疫注射禽类优选为鸡。在此所述的病原体免疫原是通过纯化的病原体抗原或通过灭活的病原体、通过基因工程技术重组的病原体特异 性抗原或疫苗瘤苗、通过提取纯化的病原体特异性裸ＤＮＡ或ｍＲＮＡ及其与相应载体组成的重组体、病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体，另外还包括上述病原体免疫原的脂质体微粒甚至是纳米微粒；所述禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑，首选是鸡；注射部位包括肌肉、皮下、皮内、血管和生殖腔囊；注射方法包括将上述病原体免疫原单独进行注射和多种免疫原联合进行多次重复免疫注射，其中所述的多种病原体免疫原联合进行免疫注射包括用不同种类和来源的病原体抗原、基因重组病原体特异性抗原或疫苗瘤苗、病原体特异性裸ＤＮＡ或ｍＲＮＡ及其重组体中的任一种或其组合物；还包括不同种类和来源的病原体特异性单克隆或多克隆抗体中的任一种或其组合物；所述的免疫原注射量为１－２ｍｌ（免疫原量１０－５００μｇ／ｍｌ＋等量不完全福氏佐剂，其中抗体Ａｂ１的用量为１００～２０００μｇ／ｍｌ＋等量不完全福氏佐剂）。所述的病原体包括病毒、衣原体、支原体、立克次氏体、细菌、螺旋体、真菌和原虫、蠕虫、线虫等人体寄生虫中的任一种或其组合；所述传染性疾病病原体包括艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、结核、幽门螺杆菌性胃炎、梅毒、淋病等性传播性疾病、病毒性肠炎、病毒性肺炎、病毒性脑炎、支原体、衣原体肺炎、斑疹伤寒、疱疹、风疹流感及寄生虫感染等疾病的病原体中的任一种或其组合。ｂ）上述病原体免疫原用不完全佐剂进行追加免疫反应。ｃ）待５－２０ 天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述病原体免疫原的蛋黄抗体存在和储存。其中所述的蛋黄抗体包括针对于上述病原体抗原、病原体、重...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭占军，赵华，郭爱芹，杨焕云，张慧，尹连杰，
申请(专利权)人：郭占军，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]