一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法技术

一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述方法至少包括：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。本发明专利技术可快速识别细胞群中不表达某一抗原的方法，可对不表达某一抗原的细胞，如U87细胞、CTC细胞等，进行染色，操作简单，实验步骤少，容错率低，节省大量人力，便于后续细胞分离及读片。

【技术实现步骤摘要】
一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法
本专利技术涉及一种免疫荧光染色方法，尤其涉及一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性染色方法。
技术介绍
免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。免疫荧光技术主要包括直接染色法、间接法和抗补色染色法。直接染色法的操作流程为：将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经过一定温度和时间的染色，洗去未产假反应的多余光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。其优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照,抑制试验对照。间接染色法用于检查未知抗原，其操作流程为：先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗傣用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血滴)。抗补色染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体复合物，发出荧光。抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原抗体系统。因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体抗补体法等。如专利号为201410659745.9，专利名为一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置，本专利技术公开了一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置。具体地，本专利技术公开了一种单个循环肿瘤细胞的分离方法，先对外周血样本进行阴性富集，获得富集的CTC细胞样本；分别使用第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二荧光标记的抗CD45抗体对富集的CTC细胞样本进行荧光染色，并对染色后的CTC细胞样本进行稀释；对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。该方法为抗补体染色法，对表达抗原的细胞，如白细胞，进行荧光染色，而CTC细胞即为不表达抗原的细胞，该方法操作步骤复杂，在细胞样本量大的情况下，其鉴别分离难度大，无法快速操作，因为在CTC细胞检测过程中，白细胞的数量为几万甚至几十万，而CTC细胞则只有3、4个，因此使用现有的荧光染色方法识别分离过程麻烦，读片容易产生差错。因此，专利技术人专利技术了一种识别细胞群中不表达某一抗原的方法，可对不表达抗原的细胞进行染色，与现有的免疫荧光技术是互补的染色方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单，容错率低，可快速识别不表达抗原的细胞免疫阴性荧光染色方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，所述方法至少包括：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。为了使所有细胞均能染色，所述荧光剂包括细胞核荧光剂和细胞蛋白胺基荧光剂。优选地，所述荧光剂为所述细胞核荧光剂时，所述方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，2)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，3)荧光淬灭剂洗脱，4)荧光显微镜观察；或所述方法包括以下步骤：1)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，2)荧光淬灭剂洗脱，3)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，4)荧光显微镜观察。优选地，所述细胞核荧光剂为DAPI。优选地，所述荧光剂为所述细胞蛋白胺基荧光剂时，所述免疫阴性荧光染色方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞蛋白胺基进行无差别荧光染色，2)荧光剂洗脱，3)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，4)荧光淬灭剂洗脱，5)荧光显微镜观察。优选地，所述抗体为EGFR抗体或CD45抗体。优选地，所述抗体与所述荧光淬灭剂按照质量比以1:0.01进行配比。优选地，所述荧光淬灭剂标记的抗体的制备方法包括：1)配制0—4℃1mg/ml抗体溶液备用；2)根据所述抗体抗体与荧光淬灭剂的质量比为1:0.01，称取所述荧光淬灭剂，配制成0.01mg/ml的荧光淬灭剂溶液；3)将所述抗体溶液与荧光淬灭剂溶液按照体积比1:1混合，充分搅拌后，在0—4℃冰箱中静置；4)所述荧光淬灭剂溶液与抗体溶液结合完毕后，将该溶液离心过滤，将上清液装入透析袋中透析；5)取上述透析袋内的溶液，加入缓冲液混合均匀后形成荧光淬灭剂-抗体溶液。为了去除多余的未反应的荧光淬灭剂，所述步骤5)中的缓冲液为伯胺类缓冲液。优选地，所述方法包括以下步骤：1)将实验细胞进行离心，用1×PBS缓冲液吹悬，涂敷在载玻片上，并烘干；2)将烘干后的细胞载玻片，使用所述荧光淬灭剂标记的抗体覆盖细胞涂片区，进行抗体孵育；3)使用PBST缓冲液洗脱；4)使用所述细胞核荧光剂DAPI覆盖细胞涂片区，并盖上盖玻片；5)荧光显微镜进行观察。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：快速识别细胞群中不表达某一抗原的方法，可对不表达某一抗原的细胞，如U87细胞、CTC细胞等，进行染色，操作简单，实验步骤少，容错率低，节省大量人力，便于后续细胞分离及读片。附图说明图1为TideQuencher1(荧光淬灭剂)的淬灭波长示意图、图2为实验组A组10X细胞染色示意图。图3为实验组B组10X细胞染色示意图。图4为实验组C组10X细胞染色示意图。图5为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述方法至少包括：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述方法至少包括：使用荧光剂对所有细胞的细胞核或者蛋白胺基等进行无差别荧光染色和使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别。


2.如权利要求1所述的快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述荧光剂包括细胞核荧光剂和细胞蛋白胺基荧光剂。


3.如权利要求2所述的快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述荧光剂为所述细胞核荧光剂时，所述方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，2)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，3)荧光淬灭剂洗脱，4)荧光显微镜观察；
或所述方法包括以下步骤：1)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，2)荧光淬灭剂洗脱，3)使用荧光剂对所有细胞的细胞核进行无差别荧光染色，4)荧光显微镜观察。


4.如权利要求3所述的快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述细胞核荧光剂为DAPI。


5.如权利要求2所述的快速识别不表达抗原细胞的免疫阴性荧光染色方法，其特征在于：所述荧光剂为所述细胞蛋白胺基荧光剂时，所述免疫阴性荧光染色方法包括以下步骤：1)使用荧光剂对所有细胞的细胞蛋白胺基进行无差别荧光染色，2)荧光剂洗脱，3)使用荧光淬灭剂标记的抗体对细胞进行抗原识别，4)荧光淬灭剂洗脱，5)荧光显微镜观察。


6.如权利要求1所述的快速识别不...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙开宇，汤继辉，周海霞，解华，
申请(专利权)人：上海科医联创医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31