控制水相介质的微生物质量的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种控制环境水相介质的微生物质量的方法，该介质被怀疑含有各种微生物，包括下列步骤：选择一个参比组，它包括至少三种微生物，联合或分别代表一种微生物质量水平；提供微生物学检测试剂盒，含有至少三种探针，它们分别特异性鉴定所述的三种微生物；在处理要分析的介质后，使所述微生物或任何从要分析的介质衍生的任何组分与所述检测试剂盒接触，从而对所述微生物进行多重检测，所述检测代表介质的微生物质量水平。本发明专利技术还涉及一种实施所述方法的合适的微生物学检测试剂盒。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物学诊断领域，鉴定和定量检测存在于液体和产品，例如水中的微生物的检测技术。它还涉及分析试剂盒和方法，使得可以对大体积样品在一天之内进行微生物的鉴定和定量，并可任选地通过这些分析结果实现产品-监控，或甚至伺服控制纯化和生产技术。微生物鉴定的常规方法需要在所选培养基上培养的步骤，一般然后根据形态、生物化学和/或免疫学特征鉴定。这些方法对于生长缓慢的细菌时间长达一天到几周，例如对于军团菌为10-12天，对于分枝杆菌长达一个月，当用于复杂的多微生物样品(水、环境和食物)时特异性较差，较不灵敏。另外，不能检测由于环境因素或杀菌处理的压力能存活但不可培养(VBNC)的细菌，也不适合自动化。10多年来，分子生物学方法，特别是那些基于体外酶扩增(PCR)和寡核苷酸探针的使用的方法，已经使得微生物学诊断发生了革命。由于其快速、灵敏性和特异性，它们成为在水样或其它样品中检测特定指示菌或病原性微生物的常规方法的替代方法，使得能够检测这些微生物在环境中的存在。在用于检测水样或任何样品中的特定指示菌或病原性微生物的分子生物学方法中，使它有可能检测环境中存在这种微生物，特别提到的可有以下几种为了检测通常在水的卫生控制中寻找的粪便污染指示菌(全部耐热性大肠杆菌型，大肠杆菌)，开发了用于饮用水样品的基于用探针PCR-杂交的迅速测定，特别是.然而，这些粪便污染的指示菌不能预测非粪便来源的细菌污染(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、军团菌等)或非细菌污染物(病毒和寄生虫)的存在。因此，开发了用于特别搜索病原性微生物(细菌、病毒、寄生虫)的基于PCR的分子检测试验。在细菌检测领域中，特别应注意欧洲专利EP-A-O 438 115，它描述了一种通过在水环境样品中一步体外酶扩增，检测军团菌病原性微生物和粪便污染指示菌的方法。几种出版物也提到了PCR试验，用于检测水和环境中的沙门氏菌和军团菌。US-B-5,298,392描述了粪便污染指示菌和病原体的检测。在病毒检测领域中，由于病毒的存在与水的卫生控制中常规查找的粪便污染指示菌无关，需要迅速和有效的分析方法，特别是控制水的病毒污染的方法。检测水和环境中病毒的常规方法需要一个动物细胞培养步骤，这是一种冗长、费力和限制的方法，仅限于几种病毒家族。为了搜索水和环境中的病原性微生物，描述了许多基于酶扩增步骤的方法。例如对于在水样中采用RT-PCR检测肠病毒、甲肝病毒和轮病毒和。在寄生虫检测领域中，特别是检测贾第虫属和隐孢子虫属的领域中，开发了常规标准化方法(EPA 1622-1623和DWI)。这两种寄生虫以被囊形式(卵囊和囊)在水和环境中传播，使它们对于常规消毒处理，例如氯化具有特别抗性。这些方法包括一个过滤步骤，然后免疫磁性捕获(IMS)卵囊，用免疫荧光(IFA)分析。这些方法耗时长且苛刻，对于人病原性的物种(吸吮贾第虫(Giardia lamblia)和短小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)没有特异性，不能检测到病原体的存活率。已描述了更迅速、灵敏和特异的，基于酶扩增步骤(PCR)的分子方法。WO-A-94/02635，WO-A-97/02281和US-A-5,693,472描述了检测水和/或生物样品中的短小隐孢子虫的引物和探针。EP-A-0 453 290和US-A-5,558,989描述了一种检测吸吮贾第虫的方法，它在人中具有病原性，该方法基于使用对应于18SrRNA序列的核酸(DNA和/或RNA)探针。EP-A-0 550 883描述了一种用搜索吸吮贾第虫的试剂的PCR试验，其灵敏度是水浓缩物的1-5个卵囊/毫升。描述了分子方法，它区别死寄生虫和活的和/或感染性寄生虫，从而可以获得对由于水中存在这些寄生虫，对实际卫生造成的危险有更好评估。特别提到的是WO-A-97/42349，它涉及活的(通过检测hsp70热休克蛋白mRNA)和/或感染性(细胞培养物和酶扩增)隐孢子虫和贾第虫的检测，和US-A-5,556,774，它涉及通过联合PCR步骤和体外脱囊步骤检测活隐孢子虫的方法。虽然上述引用的，用于搜索污染指示菌和病原性微生物，包括细菌、寄生虫和病毒的主要分子方法比常规方法在快速性、灵敏性和特异性上都有效得多，它们每次试验仅针对一种类型的微生物。因此，为了测定或检测几种参数，需要进行与要测定或检测的参数次数相等的特异性试验，它使得完整的微生物学分析极其费力。描述了几种多检测方法，但其多检测的能力差，因为它们最多只能检测3种参数。特别提到的是多重PCR技术，它包括在同一试管中进行几次PCR反应。例如，在中，描述了同时检测军团菌和侵肺军团菌(L.pneumophila)，和同时检测大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌，在中，描述了全部大肠杆菌型、大肠杆菌和志贺氏菌的同时检测，在EP-A-0 438 115中，描述了军团菌和粪便污染指示菌的检测。用两种或最多三种荧光探针进行的原位杂交(FISH)技术可以同时检测几个参数，但灵敏度比上述酶扩增方法低。在出版物中，，描述了一种方法，用于在太空中同时检测水和空气中的微生物。该方法仅针对细菌，例如大肠杆菌和解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)，通过在固相载体(96孔微量平板)上直接杂交16SrRNA。没有酶扩增步骤，灵敏度不是很高，多重检测的能力限于几种微生物；然而，描述了用涉及生物芯片的技术检测水和空气中多重的方法。在继续之前，为了清晰度和清楚理解起见，需要限定一些在说明书和权利要求中使用的术语。“核苷酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是一条通过磷酸酯键装配的核苷酸基序链，特征是天然核酸的信息序列能够在预定条件下与核苷酸片段杂交，链可能含有不同结构的单体，并从天然核酸分子和/或基因重组和/或化学合成获得。“核苷酸基序”是单体的衍生物，它可以是核酸的天然核苷酸，其组成元件是糖、磷酸基团和含氮碱基；在DNA中，糖是2-脱氧核糖，在RNA中，糖是核糖；取决于它是DNA还是RNA，含氮碱基可选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或单体可以是核苷酸，其上述三个组成元件的至少一个发生了改变；例如修饰可以在碱基水平，具有修饰的碱基例如次黄嘌呤核苷、5-甲基脱氧胞嘧啶核苷、脱氧尿苷、5-二甲基氨基脱氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿苷或任何其它能够杂交的修饰的碱基，或在糖水平，例如用聚酰胺替换至少一个脱氧核糖，或在磷酸基团水平，例如用选自二磷酸酯、烷基和芳基磷酸酯和硫代磷酸酯的酯替换。术语“信息序列”意味着核苷酸型的基序的任何有序系列，其化学性质和其参比方向的顺序与天然核酸含有相同质量的信息。术语“杂交”是指一种过程，其中在合适的条件下，两条具有足够互补序列的核苷酸片段能形成具有稳定的特异性氢键的双链。“能与多核苷酸杂交”的核苷酸片段是一种能与所述多核苷酸在杂交条件下杂交的片段，这种杂交条件对于多种情况能够以已知方式确定。杂交条件是由严格性决定的，即操作条件的严格程度。进行杂交的严格度越高，特异性越强。严格性特别定义为探针/靶二倍体的碱基组成的函数，也通过两条核苷酸之间错配程度确定。严格性还依赖于反应参数，例如存在于杂交溶液中离子的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制倾向于含有各种微生物的水环境介质的微生物质量的方法，其特征在于，－选择参照组，由至少三种微生物组成，共同或分别代表微生物质量水平，－提供微生物学检测试剂盒，含有至少三种鉴定性探针，它们分别特异性鉴定所述的三种微生物，－在处理要分析的介质后，使所述微生物或任何从所述微生物获得的组分与所述检测试剂盒接触，从而能对所述微生物进行多重检测，－该检测代表介质的微生物质量水平。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P雷诺，E吉约，C马比莱特，C瓦雄，B拉克鲁瓦，G韦尔内，MA阿曼德，P拉费尔，
申请(专利权)人：比奥麦利尤股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]