一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：用二甲基亚砜作为溶剂制备盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明专利技术的检测方法可以消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。

【技术实现步骤摘要】
一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法。
技术介绍
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应——“热原反应”，甚至导致死亡。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。制剂中的细菌内毒素，最大来源为生产用原辅料，因此，生产制剂的原辅料的内毒素水平同样需要监控。盐酸右美托咪定是一种麻醉药，其注射液用于多种外科手术及重病监护患者机械通气时短期镇静的麻醉辅助药和于手术后镇痛，因此用于制剂生产的盐酸右美托咪定原料，也需要进行细菌内毒素检测。目前，细菌内毒素检测主要有两种方法，分别为：凝胶法和光度法。凝胶法操作简单，普及程度高，试验条件要求低(37±1℃，60±2分钟)。而光度法，操作相对复杂，普及程度低，试验需要酶标仪等专业的设备。凝胶法因上述优势，被各国药典选择作为仲裁试验的方法(当内毒素检测结果出现争议时，以凝胶法结果为准)。盐酸右美托咪定水溶液pH较低，且分子中含有具有螯合作用的“咪唑基”，这两个因素都会对细菌内毒素产生干扰作用。当使用NaOH溶液调节样品溶液pH值或使用稀释剂I减缓螯合作用并调节pH值时，都会引起盐酸右美托咪定从水溶液中析出，并且该析出影响了细菌内毒素的回收，回收率不足50％。目前市面上采用的消除上述抑制作用的方法主要为：对盐酸右美托咪定进行较大倍数的稀释后，采用光度法进行细菌内毒素检测。然而，光度法检测时，操作复杂，试验需要酶标仪等专业的设备，普及程度低。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法。本专利技术的技术方案如下：一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：以二甲基亚砜作为溶剂制备5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜(DMSO)和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水(BET水)将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查；所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为20％～50％。本专利技术对供试品溶液按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。本专利技术中提及的稀释剂I的英文名称为DilutionSolutionI，生产的企业为湛江安度斯生物有限公司。稀释剂I是一种辅助剂，用于枸橼酸盐类抗凝剂及一些会导致鲎反应溶液中二价离子缺失的样品的菌内毒素检查。中国药典及美国药典的细菌内毒素检查法允许使用辅助剂来消除鲎试剂试验的干扰因素。在本申请中，溶解盐酸右美托咪定时，二甲基亚砜(DMSO)用量很重要，当二甲基亚砜(DMSO)的用量较低时，样品不能充分溶解，在后续稀释时易析出，不利于检测样品中内毒素的含量；二甲基亚砜(DMSO)的用量过高会破坏样品中细菌内毒素，从而影响检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素含量的准确性，会使检测结果呈现“假阴性”。在本专利技术中，溶解盐酸右美托咪定时，盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～25mg/mL。在一种优选方案中，盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～15mg/mL。例如，盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL或者10mg/mL。对于本专利技术而言，进行细菌内毒素检查的供试品溶液中二甲基亚砜(DMSO)的浓度也有严格限定，二甲基亚砜(DMSO)的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。本专利技术对供试品溶液中二甲基亚砜(DMSO)的浓度进行了干扰实验，对DMSO对细菌内毒素的无干扰进行了确认，得出DMSO对细菌内毒素检测的无破坏体积浓度为≤2.5％。针对本专利技术细菌内毒素的检查方法，在一种优选方案中，供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度为1.5％～2.25％。例如，可以但不局限于1.5％或2.25％。在本专利技术中，制备供试品溶液时，稀释剂I的浓度很重要，对供试品中稀释剂I的浓度要也要严格控制，稀释剂I的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。当稀释剂I的浓度过低时，不能充分消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素检测的干扰作用，而使检测结果呈现“假阴性”；当稀释剂I的浓度较高时，破坏了样品中的细菌内毒素，也会使检测结果呈现“假阴性”。本专利技术中，稀释剂I在供试品溶液溶液中的体积浓度为20％～50％范围内，能有效检测样品中内毒素含量。在一种优选方案中，供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为23.5％～47.75％。例如，可以但不局限于23.5％或47.75％。在制备供试品溶液时，采用二甲基亚砜、稀释剂I以及细菌内毒素检查用水或者仅仅采用稀释剂I以及细菌内毒素检查用水进行稀释，在不低于最低有效活性浓度的情况下，先以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最低有效活性浓度，再以该最低有效活性浓度制成的供试品溶液，按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。在本专利技术中，检查盐酸右美托咪定中细菌内毒素时，根据待测盐酸右美托咪定细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最低有效活性浓度，其中：所述盐酸右美托咪定细菌内毒素限值为0.1EU/mg；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最低有效活性浓度为0.15mg/mL。本专利技术检查盐酸右美托咪定中细菌内毒素时，待测盐酸右美托咪定的内毒素限值为0.1EU/mg；选择的鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL，以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验时，找出无干扰情况下的有效活性浓度为0.3mg/mL和0.15mg/mL(最低有效活性浓度)，再以稀释至浓度为0.15mg/mL的供试品溶液进行细菌内毒素检查。本专利技术采用凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的含量，只需要用二甲基亚砜(DMSO)溶解盐酸右美托咪定制成5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，再以二甲基亚砜(DMSO)和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水(BET水)将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液，供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，稀释剂I的体积浓度为20％～50％，即可消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用，相对于光度法检测，操作方便、简单。本专利技术的专利技术人在确定本专利技术的检查方法之前，分别使用了以下三种方法制备供试品溶液，均无法成功检测盐酸右美托咪定中的细菌内毒素：①用细菌内毒素检查用水溶解并稀释盐酸右美托咪定至浓度为5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：以二甲基亚砜作为溶剂制备5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查；所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为20％～50％。/n

【技术特征摘要】
1.一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：以二甲基亚砜作为溶剂制备5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查；所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为20％～50％。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～15mg/mL；优选为10mg/mL。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度为1.5％～2.25％；优选为1.5％。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为23.5％～47.75％；优选为23.5％。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最低有效活性浓度，再以该最低有效活性浓度制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。


6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其特征在于，先以盐酸右美托咪定细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最低有效活性浓度，其中：所述盐酸右美托咪定细菌内毒素限值为0.1EU/mg；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最低有效活性浓度为0.15mg/mL。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐咏群，冷玲，
申请(专利权)人：南京健友生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32