一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明专利技术所述方法中可排除杂蛋白对结合反应的影响，降低了实验假阳性，还可以快速精准的检测DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。以杨树OM47基因启动子区域DNA甲基化修饰对BPC2转录因子结合的影响为例，OM47基因启动子区域未被DNA甲基化修饰的DNA序列与BPC2蛋白具有明显的结合条带，并随着冷探针竞争浓度的增加逐渐变浅，而被DNA甲基化修饰的启动子序列与BPC2蛋白没有明显的结合条带，证明启动子区域的DNA甲基化修饰会抑制与转录因子蛋白的结合效率。

【技术实现步骤摘要】
一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法。
技术介绍
转录因子(transcriptionfactor，TF)是能与其靶基因启动子区域特定DNA序列结合的一类蛋白，直接激活或抑制靶基因转录，从而精细调控靶基因的表达模式与水平，在生物体生长发育及对外界环境的反应中起着至关重要的作用。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰类型，在核酸序列不发生改变的条件下，通过DNA甲基化修饰使基因功能发生可遗传变化并最终导致表型变异，被认为是动植物调控基因表达的重要形式之一。在高等真核生物中，DNA甲基化主要通过DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基基团转移至胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)。目前，大量研究表明基因启动子区域的DNA甲基化修饰会抑制与转录因子的有效结合，并且DNA甲基化修饰被认为是基因沉默的标记，特别是启动子区被高水平甲基化修饰的基因通常处于失活状态，而转录因子与基因启动子区域结合位点的特异性结合是基因转录调控的关键因素，因此，检测DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响，有利于进一步揭示DNA甲基化修饰以及转录因子调控其下游基因的功能分子机制。然而，目前没有快捷有效的方法检测启动子区域DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，可以简单有效的研究DNA甲基化修饰对转录因子的结合影响。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，包括以下步骤：(1)诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白；(2)根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针；(3)使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响；步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。优选的，步骤(1)中利用原核表达方法诱导所述转录因子表达编码蛋白。优选的，步骤(1)中利用表达得到的蛋白所携带的标签进行纯化。优选的，步骤(3)进行所述结合反应时，还包括：设置所述纯化蛋白与未进行DNA甲基化修饰以及所述启动子DNA探针的结合反应体系，同时设置冷探针的竞争梯度，从而根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力。本专利技术提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，包括通过凝胶迁移实验检测DNA甲基化修饰，从而影响转录因子结合。本专利技术所述方法中包括对目的蛋白的纯化，排除杂蛋白对结合反应的影响，降低了实验假阳性；该方法利用生物信息学与分子生物学结合的方法，可以快速精准地检测DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。在本专利技术实施例中，检测杨树OM47基因启动子区域DNA甲基化修饰对BPC2转录因子结合的影响时，OM47基因启动子区域未被DNA甲基化修饰的DNA序列与BPC2蛋白具有明显的结合条带，并随着冷探针竞争浓度的增加逐渐变浅，而被DNA甲基化修饰的启动子序列与BPC2蛋白没有明显的结合条带，证明启动子区域的DNA甲基化修饰会抑制与转录因子蛋白的结合效率。附图说明图1为本专利技术所述方法的流程示意图；图2为BPC2蛋白纯化效果图，其中泳道M为180KDamarker；CL为细菌裂解液(celllysate)；FT为上样流穿液(flowthrough)；W1和W5为洗涤液1、5(wash1、5)；E1～E5分别为洗脱液1～5(elution1～5)；图3为OM47基因启动子DNA甲基化修饰EMSA结果图，其中m代表甲基化修饰的启动子序列。具体实施方式本专利技术提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，包括以下步骤：(1)诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白；(2)根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针；(3)使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响；步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。本专利技术诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白。本专利技术优选利用原核表达方法诱导所述转录因子表达编码蛋白。本专利技术对所述原核表达的具体步骤并没有特殊限定，优选包括：构建基因原核表达载体；将构建好的载体转入BL21大肠杆菌；用终浓度为1mM的IPTG诱导蛋白表达；通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白的表达；收集诱导表达后的菌体，提取蛋白。本专利技术对提取得到的蛋白进行纯化，优选的根据表达得到的蛋白所携带的标签进行纯化。本专利技术根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针。本专利技术优选通过生物信息学确定转录因子结合位点后，设计特异性DNA探针，并对DNA探针所携带的胞嘧啶进行甲基化修饰，而后标记生物素。本专利技术对所述生物素标记的方法并没有特殊限定，优选采用碧云天EMSA探针生物素标记试剂盒对探针进行生物素标记。本专利技术对所述探针进行生物素标记后，可便于后期检测蛋白-DNA复合物。得到纯化蛋白和启动子DNA探针后，本专利技术使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。本专利技术优选根据蛋白-DNA复合物以及游离探针条带的相对位置检测目的蛋白与DNA的结合。本专利技术对所述结合产物的检测方法并没有特殊限定，优选采用化学发光法检测DNA探针，在本专利技术实施例中选择碧云天化学发光法EMSA试剂盒进行检测。本专利技术在利用碧云天化学发光法EMSA试剂盒设置结合反应体系时，优选包括分别设置目的蛋白与未进行DNA甲基化修饰以及DNA甲基化修饰后探针的结合反应体系，并通过设置冷探针的竞争梯度，从而根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，更优选的包括：具有明显的蛋白-DNA结合条带，表明转录因子的结合未受抑制，而随着冷探针竞争浓度的增加，蛋白-DNA结合条带逐渐变浅，被DNA甲基化修饰的启动子序列与蛋白没有明显的结合条带，表明DNA甲基化会明显抑制转录因子的结合。下面结合实施例对本专利技术提供的检测DNA甲基化修饰影响转录因子的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白；/n(2)根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针；/n(3)使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响；/n步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白；
(2)根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针；
(3)使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响；
步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德强，房媛媛，肖亮，权明洋，王丹，杜庆章，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11