一种金磁复合纳米构建的增敏型SPR免疫传感器检测多菌灵制造技术

本发明专利技术公开了一种灵敏度高、在线实时、快速高效监测多菌灵残留的检测方法和应用，属于农残检测领域。本发明专利技术利用金纳米和磁纳米信号放大和易于分离操作的优势，制备了金磁纳米增敏SPR生物传感器，不仅有效防止纳米粒子团聚，改善纳米粒的稳定性、分散性及生物相容性，而且可极大提高多菌灵免疫检测的灵敏度至0.44ng·mL

【技术实现步骤摘要】
一种金磁复合纳米构建的增敏型SPR免疫传感器检测多菌灵
本专利技术涉及一种金磁复合纳米构建的增敏型SPR免疫传感器检测多菌灵农药残留，特别是涉及金磁复合纳米的制备，金磁复合纳米增敏型SPR芯片的构建、免疫传感器的组装及多菌灵农残的检测，其属于农残检测领域。
技术介绍
多菌灵是上世纪70年代中期由美国杜邦公司开发研制的一种内吸性杀菌剂，低毒，可有效防治由真菌(如半知菌、多子囊菌)引起的多种作物病害，具有高效、广谱、持效期长、使用成本低等特点，己成为国内产量最大的内吸性杀菌剂品种之一。我国多菌灵制剂年需求量在1万吨以上，单一制剂企业200余家，复配制剂企业600余家[2]，年产量可想而知。多菌灵不仅在农业上应用广泛，在中药材如人参、黄芪、远志等在种植过程频繁应用于防治根腐病、黑斑病、立枯病等的侵袭，为了防治此类病害，50％多菌灵常常800～1000倍液灌根或喷洒，有的建议每隔7天施药一次。此外，甲基硫菌灵也作为常用杀菌剂使用，该化合物施药后可迅速转化中多菌灵。实际调研中发现，该产品杀菌谱广，使用成本低，直接从事种植生产的药农大多文化程度不高，对科学用药常识和病虫害防控技术掌握不够，盲目、超范围、超剂量用药现象普遍，极易造成中药中残留污染甚至严重超标问题。建立快速灵敏高效的检测方法对源头控制多菌灵残留超标具有重要意义。表面等离子体共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)生物传感器是上世纪八十年代兴起的生物传感检测技术，具有用量小、实时、在线检测、快速等优势，已广泛应用于生命科学、食品安全、环境污染等领域。SPR生物传感器应用于小分子外源性污染物检测广阔前景，然而受小分子免疫技术限制，其灵敏度有待提高。磁纳米(magneticnanoparticles，MNPs)作为新型功能材料，具有超顺磁性、悬浮稳定性、低毒性等特点，常作为负载生物识别分子的载体。然而，MNPs易团聚，通过金纳米(goldnanoparticles，GNPs)包覆的金磁复合材料可避免MNPs的易团聚缺陷，兼顾GNPs对SPR敏感的折射率，有助于提高灵敏度，且GNPs易于制备、生物相容性及化学稳定性优异，因此金磁复合纳米材料作为小分子化合物的免疫分子载体，构建的SPR生物传感器可简化操作步骤、提高检测灵敏度、特异性和抗干扰等，应用于食品快筛、环境污染检测、临床诊断和医药安全等研究具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、在线实时、快速高效监测多菌灵残留的SPR检测方法，其优点在于以金磁纳米增敏SPR响应，可极大提高多菌灵免疫检测的灵敏度。采用混合组装法制备金磁复合纳米，以多菌灵抗体修饰获得生物探针，基于SPR芯片，在线监测枸杞中多菌灵残留检测研究，该方法快速简便、灵敏度高、实时在线具有广阔的开发前景。技术解决方案本专利技术采用的技术方案是：合成并修饰磁纳米粒子，混合组装法制备金磁纳米复合材料；将EDC/NHS活化后的金磁复合物表面偶联多菌灵抗体，制备多菌灵检测的生物功能化探针；利用SPR实时检测功能，实现SPR芯片在线免疫传感膜修饰；制备对搭建的增敏SPR传感器进行特异性、芯片再生研究测试，并应用于中药材中多菌灵残留检测。技术要点：(1)金磁复合纳米材料的混合组装制备：①利用氯化铁和氯化亚铁原料脱氧水浴加热制备四氧化三铁磁纳米粗品，经过磁分离纯化，获得磁纳米悬浮液；加入稳定剂柠檬酸，在加热条件下，对磁球表面进行修饰。②调节柠檬酸钠还原剂pH至8～10，在加热的条件下，氯金酸溶液加入磁纳米-柠檬酸混合体系中，制备金包覆的金磁纳米，最终经过磁分离纯化，获得金磁复合材料，并进行透射电镜表征。(2)多菌灵抗体标记的功能化生物探针制备：将羧基化的金磁复合物，利用EDC/NHS混合液活化表面，加入多菌灵抗体，使抗体的氨基与金磁表面的羧基共价反应，对表面未反应的活性官能团进行BSA封闭，获得功能化生物探针。(3)SPR芯片免疫传感膜修饰：在CM5芯片表面，通过SPR系统的微流控流路控制，依次通过PBS、EDC/NHS、多菌灵抗原、BSA溶液在线完成清洗、活化、偶联、封闭步骤，对SPR芯片进行修饰。(4)SPR增敏型免疫传感器检测中药中多菌灵残留①利用SPR增敏型免疫传感器对多菌灵结构类似物进行选择性检测考察，通过响应抑制确定该系统对多菌灵检测的专属性。②制备系列浓度的多菌灵溶液，进样SPR系统，利用多菌灵与CM5芯片表面抗原竞争结合金磁负载多菌灵单抗，引起的响应信号变化，绘制标准曲线，确定工作浓度范围和检测灵敏度。③优化不同的洗脱溶液，考察SPR芯片的再生条件，实现芯片的可重复使用。④将阴性验证的枸杞样品经过不同加标水平，制备已知浓度多菌灵的枸杞样品，利用构建的增敏型SPR传感器检测分析，考察其检测准确度。有益效果：本专利技术通过合成了磁纳米粒子、金磁纳米粒，并在金磁纳米表面偶联了多菌灵抗体，制备了多菌灵检测的生物功能化探针，对SPR芯片表面进行抗原修饰，建立了多菌灵残留检测的高灵敏SPR免疫传感器，该方法的检测灵敏度高，操作简单，实时在线监测，可用于环境、农产品、中药中多菌灵农药残留现场快速检测。附图说明：①图1为金磁纳米Fe3O4/Au纳米粒子的SEM图和TEM图②图2为不同浓度生物功能化金磁复合纳米探针结合等浓度抗原动力学吸附曲线图③图3为增敏型SPR生物传感器检测多菌灵分析原理图④图4为增敏型SPR生物传感器和传统SPR生物传感器检测多菌灵抑制曲线图⑤图5为增敏型SPR生物传感器检测多菌灵特异性分析图⑥图6为四种再生溶液再生后基线响应信号和样品结合响应信号图具体实施方式：通过以下实施例对本专利技术进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。实施例1：磁纳米制备①取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O(摩尔比1∶1)溶解在超纯水中，搅拌、通入氮气脱氧并同时快速通入饱和氨水，然后开始水浴加热，在70℃-75℃保持10-15分钟，得到黑色的Fe3O4纳米粒子粗产品，结束反应，磁性分离，反复洗涤至中性，重新分散在超纯水中形成Fe3O4纳米粒子的悬浮液。②将Fe3O4磁纳米粒子的悬浮液转入反应器，搅拌后通氮加入1％稳定剂柠檬酸溶液，开始水浴加热，在70℃保持10分钟。结束反应后冷却至室温，磁性分离，反复洗涤后，重新分散在超纯水中，作为磁性纳米粒子储备液。实施例2：金磁复合纳米制备①还原剂溶液预处理：配制还原剂溶液，取0.0017g柠檬酸钠溶液于33.2mL水中，调pH值为8～10，形成还原剂水溶液，将此溶液分为两份，其中一份加热回流。②Fe3O4磁纳米粒子表面包金：将2mL磁性纳米微粒储备液加到4mL的柠檬酸钠溶液中混合，并利用超声混匀分散，待另一份柠檬酸钠溶液加热至沸腾时，将此时混合液加入反应器中；当溶液温度回升至沸腾时加1％氯金酸溶液：在100℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金磁纳米构建的增敏型SPR免疫传感器用于多菌灵检测的快检技术，其特征在于：/n(1)以磁纳米为核心，柠檬酸钠还原磁纳米表面的氯金酸，混合组装制备金磁复合纳米材料；/n(2)将羧基化的金磁复合物，利用EDC/NHS活化表面，共价偶联多菌灵抗体，并进行蛋白封闭，制备功能化生物探针；/n(3)基于增敏型SPR传感器检测样品中多菌灵残留，经过不同洗脱液再生处理SPR芯片。/n

【技术特征摘要】
1.一种金磁纳米构建的增敏型SPR免疫传感器用于多菌灵检测的快检技术，其特征在于：
(1)以磁纳米为核心，柠檬酸钠还原磁纳米表面的氯金酸，混合组装制备金磁复合纳米材料；
(2)将羧基化的金磁复合物，利用EDC/NHS活化表面，共价偶联多菌灵抗体，并进行蛋白封闭，制备功能化生物探针；
(3)基于增敏型SPR传感器检测样品中多菌灵残留，经过不同洗脱液再生处理SPR芯片。


2.根据权利要求1金磁复合纳米制备，其特征在于所述的金磁复合纳米是通过以下方法制备：
(1)取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O(摩尔比1∶1)溶解于水中，搅拌、通入氮气脱氧并同时快速通入饱和氨水，水浴加热，70℃-75℃保持10-15分钟，得到黑色粗产品，结束反应，磁分离，洗涤至中性，重新分散至超纯水中；
(2)将磁纳米悬浮液转入反应器，通氮加入1％稳定剂柠檬酸溶液，水浴加热，70℃保持10分钟后冷却至室温，磁分离，洗涤，复溶于水中；
(3)取0.0017g柠檬酸钠溶液于水中，调pH值为8～10；
(4)将2mL磁性纳米微粒储备液加至4mL柠檬酸钠溶液中混合，超声分散，待另一份柠檬酸钠溶液加热至沸腾，将此时混合液加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨美华，豆小文，李倩，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11