共价固定生物分子的蛋白质芯片及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种在固体表面上共价固定配基分子的蛋白质芯片。该芯片采用氯硅烷聚乙二醇衍生物作为改性层和固体基片共价连接，配基感应膜层通过共价键和氯硅烷聚乙二醇衍生物的活性基团连接。用这种方法制备的芯片能有效提高配基分子的稳定性，抑制固体表面对非目标蛋白质的吸附从而减少假阳性结果的发生。该芯片可以广泛用于各类生物分子如抗体、抗原、受体、配体、ＤＮＡ片段等的检测。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测用蛋白质芯片，特别涉及一种可以在固体表面上共价固定配基分子，而且能够有效抑制蛋白质分子在芯片表面上的物理吸附的蛋白质芯片及其制备方法。
技术介绍
蛋白质芯片是利用芯片表面上固定的配基分子来检测生物分子的一项新技术。配基分子在蛋白质芯片表面上固定的质量，和芯片表面对其它非目标蛋白质的吸附是影响蛋白质芯片检测的重要因素。目前，用于固定配基分子的方法大多是物理吸附法，如ELISA，RIA等检测方法中采用的固定方法。通过物理吸附法固定在芯片表面上的配基分子的稳定性差，易脱落，而且易导致配基分子变性，失去生物活性。另外，使用物理吸附法固定配基分子的蛋白质芯片表面上易吸附非目标蛋白质，导致假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固体表面上共价结合配基分子的蛋白质芯片，以克服上述通过物理吸附方法固定配基分子制备蛋白质芯片所带来的缺点如配基分子不稳定，易从芯片上脱落，易变性，而且芯片表面易发生非目标蛋白质吸附，出现假阳性检测结果等问题。本专利技术的另一目的是提供一种简单、易于实施的蛋白质芯片表面改性技术。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术提供的共价固定生物分子的蛋白质芯片，包括固体基片和配基感应膜层，其特征是在固体基片和配基感应膜层之间还包括一层改性层，改性层通过共价键分别与固体基片和配基感应膜层连接。其中所述的固体基片为半导体材料(如硅片、锗片等)、金属、玻璃、塑料或固体复合材料(如表面为金属膜、介质膜、化学膜或生物化学膜的固体复合材料)。蛋白质芯片的改性层由氯硅烷聚乙二醇衍生物构成。氯硅烷聚乙二醇衍生物分子ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX由氯硅烷，烷烃，聚乙二醇，末端基团X四部分构成。氯硅烷部分的a可以是1、2或3，即一氯硅烷(ClSi-)、二氯硅烷(Cl2Si-)或三氯硅烷(Cl3Si-)。聚乙二醇的聚合度n可以介于3到50之间，通常选择n在3-8之间，m可以是5到20之间任意正整数。氯硅烷部分易与固体表面上的羟基反应生成硅氧键，从而把该化合物共价地固定在固体表面上。烷烃部分的存在有益于氯硅烷聚乙二醇衍生物分子在表面上的有序排列。聚乙二醇分子的亲水性、柔性和电中性能够有效抑制蛋白质分子在芯片表面上的物理吸附。按照是否用于共价固定配基分子，末端基团X被分为两类一类是可以用来固定配基分子的基团，如羧基、氨基、巯基、醛基等，由于这些基团易与氯硅烷发生化学反应，所以在被用来固定配基分子前，根据不同的基团采取了不同的化学保护；另一类是惰性基团，不用来共价固定配基分子，如甲基，乙基等，带有这类惰性末端基团的衍生物抑制蛋白质分子的物理吸附效果比带有活性末端基团的衍生物更好，但是惰性基团无法活化来结合配基分子。因此，使用合适比例混合的带有活性基团和带有惰性基团的聚乙二醇衍生物改性的蛋白质芯片表面，不但能够共价固定配基分子，而且能够实现最大程度地抑制蛋白质分子在蛋白质芯片表面上的物理吸附。配基感应膜层由被检测的生物分子形成，如各种抗体、抗原、受体、配体、DNA片段等。本专利技术提供的蛋白质芯片制备方法包括以下步骤1.固体基片的选择和表面清洁处理选择固体基片材料和大小，用常规清洁处理方法进行表面清洁处理，除去表面污渍和灰尘。2.固体基片表面处理，使之带有易与氯硅烷发生化学反应的活性基团，如羟基、羧基、氨基、巯基、醛基、羰基等。如以半导体材料和玻璃为固体基片的，可以使用亲水化处理方法，使表面上带有大量羟基。以金属或表面镀金属膜的复合材料为固体基片的，可以通过巯基试剂在金属表面上引入上述活性基团。以塑料为固体基片的，可以通过等离子体处理技术在表面上引入上述基团。3.氯硅烷聚乙二醇衍生物改性层的制备将带有活性基团和带有惰性基团的氯硅烷聚乙二醇衍生物(活性基团已经化学保护)按照合适的比例(随固定的配基分子不同而不同)(1∶1至1∶100，摩尔比)溶于有机溶剂中，混合均匀。将2中准备好的固体基片浸泡于上述溶液中充分反应，清洗后备用。4.氯硅烷聚乙二醇衍生物ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX末端活性基团X的活化根据氯硅烷聚乙二醇衍生物末端活性基团的不同，对3中制备好的基片采用不同的脱保护方法处理后，再根据要固定的配基分子的种类和要固定的基团对脱保护的末端基团或配基上的基团采用不同的活化处理。5.配基感应膜层的制备将4中制备好的基片孵育在配基溶液中充分反应(反应时间随溶液浓度不同而不同)。清洗后再使用合适的封闭溶液封闭基团，即制得本专利技术的蛋白质芯片。本专利技术的蛋白质芯片适合于各种固相生物检测方法。所谓固相生物检测方法是指把配基分子首先固定在固体表面上，然后把带有配基的表面与待测溶液孵育，再通过各种检测方法检测待测溶液中是否含有能够与配基分子发生特异性结合的生物分子的一种检测方法。目前，用于固相检测的检测方法很多，如酶联免疫法、化学发光法、荧光法、同位素法、椭偏光学成象法、表面等离子共振法等。本专利技术提供的蛋白质芯片可以用于生命科学研究中生物分子检测、临床疾病诊断和生物工业生产过程中的检测等方面。本专利技术的优点1.本专利技术提供的蛋白质芯片能够共价固定配基分子，使之稳定，不易脱落。2.本专利技术提供的蛋白质芯片能够保持配基分子生物活性，不易变性失活。3.本专利技术提供的蛋白质芯片能够抑制非目标蛋白质分子的物理吸附，避免出现假阳性检测结果。附图说明图1是本专利技术的蛋白质芯片结构示意图；图面说明如下1固体基片2改性层3配基感应膜层具体实施方式实施例1按图1制备用于检测人免疫球蛋白G(IgG)的蛋白质芯片。该芯片的固体基片1选用的是0.5mm的抛光硅片。改性层2由氯硅烷聚乙二醇衍生物，它分别是Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3和Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2CH3，按1∶50(摩尔比)混合制成的。配基分子是人免疫球蛋白G(IgG)的抗体(antiIgG)。该蛋白质芯片的制备按以下步骤进行1.硅片表面的清洁处理用弱碱性溶液(如氨水)清洗硅片表面，除去表面污渍。2.硅片表面亲水化处理将步骤1处理过的硅片放入体积比为1∶3的30wt％的H2O2和98wt％的H2SO4的混合液中浸泡20分钟，取出用去离子水清洗至中性，即得到表面带有羟基的亲水基片1。3.氯硅烷聚乙二醇衍生物改性层制备把Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3和Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2CH3以1∶50摩尔比混合后溶于三氯乙烯中。把步骤2中处理的硅片放入聚乙二醇衍生物溶液中浸泡5分钟。用三氯乙烯和无水乙醇轮流清洗后，得到改性后的芯片基片；4.Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3羧基脱保护和羧基激活用稀硫酸溶液处理步骤3的基片，脱除羧基保护。再使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)处理羧基生成活泼酯衍生物；5.antiIgG膜层的制备把经过步骤4处理的基片放入antiIgG溶液中浸泡20分钟，清洗后再使用乙醇胺溶液封闭未结合antiIgG分子的活泼酯。得到检测人免疫球蛋白G(IgG)的蛋白质芯片。实施例2制备用于检测人胰岛素(insulin)的蛋白质芯片。该芯片的固体基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质芯片，包括固体基片和配基感应膜层，其特征是：在固体基片和配基感应膜层之间还包括一层改性层，改性层通过共价键分别与固体基片和配基感应膜层连接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：靳刚，王战会，
申请(专利权)人：中国科学院力学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]