心肌肌钙蛋白鲁米诺化学发光免疫分析检测方法技术

本发明专利技术属于临床血液检测分析方法技术领域利用自制抗人心肌肌钙蛋白Ｉ（ｃＴｎＩ）抗体，标记辣根过氧化物酶，用肉桂酸作发光增强剂，四苯硼钠作协同增强剂，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺－Ｈ＃－［２］Ｏ＃－［２］－肉桂酸－四苯硼钠发光系统，建立了ｃＴｎＩ鲁米诺化学发光免疫分析检测方法。该法与ＥＬＩＳＡ方法比较，结果显示两法无显著性差异（ｐ＞０．０５），相关系数ｒ＝０．９８５２，回归方程Ｙ＝１．１９３－１．００６Ｘ（Ｙ为ＣＬＩＡ方法测定值，Ｘ为ＥＬＩＳＡ方法测定值），按９５％可信区间，计算正常人参考范围的上限为２．１２ｎｇ／ｍｌ，诊断符合率为９６．１５％。保护范围：１．一种用于临床及实验室检测使用的化学发光系统。该系统的特征在于用肉桂酸作发光增强剂，四苯硼钠作协同增强剂，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺－Ｈ＃－［２］Ｏ＃－［２］发光。２．一种用鲁米诺－Ｈ＃－［２］Ｏ＃－［２］－肉桂酸－四苯硼钠体系作检测系统，检测人体血清或血浆内心肌肌钙蛋白Ｉ（ｃＴｎＩ）的检测方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床血液检测分析方法
建立了一种用于临床检测人体血清或血浆内心肌肌钙蛋白(cTnI)的定量、特异、灵敏的方法。为与全自动免疫发光仪配套，及其它化学发光试剂的研制建立了技术平台。化学发光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)，也称为免疫化学发光分析法(immunochemiluminometric assay，ICMA)，由法国巴斯德公司于1999年首先建立。这种分析方法是Arakawe1977年基于放射免疫分析的基本原理，将化学发光与免疫反应结合起来建立的一种分析方法，包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hv)，利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种，即化学发光标记免疫分析法和酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法。化学发光标记免疫分析是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物(acridiniumester AE)，是一种有效的发光标记物，通过起动发光试剂(NaOH-H2O2)作用而直接发光，强烈的发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无需催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底较低。美国拜耳公司ACS180系列全自动化学发光免疫分析系统即以吖啶酯作为标记，量度AE标记物化学反应所产生的光量为基础，灵敏度可达10-15g/L。该系统采用顺磁性微粒作固相载体，反应物形成类均相悬浮溶液，有效增大反应面积，加速免疫反应，便于自动洗涤、快速分离，方法中不用酶和催化试剂，改变pH即可发生发光反应，AE试剂稳定，有效期长达一年。目前，已临床用于甲状腺功能、生殖生理、肿瘤标志物、药物监测及心血管等四十余个项目的检测。从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免分析完全相同以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。HRP标记的CLIA常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)，或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)，是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧如过氧化阴离子(O2-)，单线态氧(1O2)，羟自由基(OH·)，或过氧化氢(H2O2)存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。该系统的代表是AmerliteTM发光酶免分析系统，目前用于临床检测的试剂盒有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素，与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、雌二醇、睾酮，以及其他方面如甲胎蛋白、癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。ALP标记的CLIA所用底物为环1，2-二氧乙烷衍生物，这是一类很有前途的发光底物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团-金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AMPPD，中文名为3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基4-(3’-磷酰氧基)-苯基-1，2-环二氧乙烷，该化合物由法国巴斯德研究所拥有专利，Meck公司合成。底物在碱性磷酸酶(ALP)作用下，磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基，得到一个中等稳定的中间体AMPD(半衰期为2～30min)，此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的光，可持续几十分钟。AMPPD为磷酸酯酶的直接化学发光底物，可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10-15mol/L。美国DPC公司的Immulite全自动酶放大发光免疫分析仪，以碱性磷酸酶为标记物，以金刚烷作发光底物，采用聚苯乙烯珠作载体，测定灵敏度相当于10-21mol/mL的酶。美国贝克曼库尔特公司推出的ACCESSOR全自动微粒子化学发光免疫分析系统，是由法国巴斯德研究所将微粒子化学发光技术发展应用设计的。其采用AMPPD-ALP发光系统，以微粒子(0.7μ)作载体，表面积大、结合快、达到最大发光信号时间短、反应及分离速度快，缩短了分析时间，有效提高了灵敏度和准确性。该系统可全自动控制整个测定和数据分析处理，具有批量和任选测定24个项目的能力和急诊插入功能，平均检测速度100T/h，冷藏试剂盘可放24种试剂，探针直接插入试剂盒，并自动封闭，直至试剂用完，不污染不浪费。超声波技术被用于搅拌使微粒悬混均匀并加速反应，用于探针取样液面检查保证取样准确，用于洗涤时减少交叉污染。由美国雅培公司生产的AxSYM全自动免疫发光分析仪将三种技术于一机，可用于非均相标记微粒子酶免发光分析(MEIA)、离子捕捉发光分析(ICIA)和均相标记荧光偏振免疫发光技术(FPIA)，目前已有83个检测项目可供临床应用。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、所需时间短、无放射性污染等特点，现已从实验室研究进入常规临床诊断应用。随着各种自动发光分析仪器的面市，以及不同类型的化学发光免疫分析试剂盒的不断推出，势必进一步推动化学发光免疫分析技术的迅速发展。另外，发光分析在用于DNA探针，蛋白印迹分析及药代动力学等方面也将越来越显示其优越性。用葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为标记物的化学发光免疫分析在生物学研究中也具有广泛的用途。本专利技术用噬菌体展示技术制备cTnI抗体，纯化后用辣根过氧化物酶标记，优化鲁米诺-H2O2-肉桂酸-四苯硼钠化学发光体系，建立了检测人心肌肌钙蛋白(cTnI)的定量检测方法，该方法检测灵敏度为0.2ng/ml，线性范围为0.4～50ng/ml，批内精密度平均9.0％，批间精密度平均11.8％，回收率为104.2％，血红蛋白浓度在0～50nmol/L，总胆红素在0～15μmol/L，甘油三脂在0～2.0mmol/L对测定结果无影响。与ELISA方法比较，相关系数r＝0.9852(p＞0.05)。用该方法检测了138例临床血清标本，诊断符合率为96.15％。本专利技术的技术方案为1、用肉桂酸作发光增强剂，四苯硼钠作协同增强剂，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-H2O2发光。2、用鲁米诺-H2O2-肉桂酸-四苯硼钠体系作检测系统，用cTnI抗体标记的辣根过氧化物酶催化发光系统，发光强度与标本中cTnI的量成正比，根据标准曲线计算标本中cTnI的浓度。四.具体实施例方式抗体的制备PC89-cTnI95-108质粒及pFD5-cTnI质粒转化XL1-Blue感受态细胞，挑单菌落接种Amp+Tet双抗LB培养液扩大培养，加入1012本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于临床及实验室检测使用的化学发光系统。该系统的特征在于用肉桂酸作发光增强剂，四苯硼钠作协同增强剂，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺－Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］发光。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈子龙，吴国球，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]