一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D得到固定化的磷脂酶D；（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为纳米生物催化剂，先将L‑丝氨酸与CaCl

【技术实现步骤摘要】
一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法
本专利技术涉及生化科技
，特别是一种用高活性及稳定性的固定化磷脂酶D作为生物催化剂制备合成磷脂酰丝氨酸的方法。
技术介绍
近年来，随着人们对磷脂类物质的深入研究，越来越明确地意识到了磷脂的药用价值和营养价值，并将它广泛应用到了食品、药物及保健品等领域。以磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)为例，它是一种重要的磷脂物质，通常位于细胞膜内层，是细胞膜的重要组成部分，能参与一系列膜功能反应。尤其在人体的神经系统中，磷脂酰丝氨酸（PS）是大脑细胞膜的重要组份之一，因其对改善记忆力、缓解压力、修复大脑损伤、治疗儿童多动症以及预防老年痴呆症等作用效果明显而市场需求量很大，故制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。目前常用的磷脂酰丝氨酸（PS）的制备方法主要有提取法与酶转化法两种，其中：提取法主要是从动物大脑组织中提取得到PS；酶转化法是利用磷脂酶D（PLD）催化卵磷脂的转酯反应制备得到PS。由于后者反应条件温和、过程简单且绿色环保而为公认的制备PS的理想方法。其中涉及的磷脂酶D（PLD），是一种磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，除具有催化磷脂的水解，释放磷脂酸(PA)和醇残基的功能外，还具有催化转磷脂酰反应的功能。由于由磷脂酶D催化的磷脂酞转移反应是一个油-水两相之间的界面反应，磷脂酶D溶解在水相中，通过搅拌与油相中的反应底物在两相界面之间接触促使反应发生，所以，酶在两相界面之间分布的越多，越能够提高反应速率。但由于磷脂酶D是水溶性的酶，与有机溶剂接触时容易聚集结块，甚至失活，故会导致反应速率下降。因此，如何才能够促使磷脂酶D向有机相靠拢而又不会造成酶活力损失、以提高转磷脂酰的反应速率，是目前业界普遍关心、正在探索和急需攻克的一大难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是要解决现有技术中所存在的问题，提供一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法。本专利技术用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，特征在于所述的固定化生物催化剂由以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体、固定游离磷脂酶D，制备得到的高活性及稳定性的固定化的磷脂酶D充任，该方法包括如下步骤：（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D，制备得到固定化的磷脂酶D，步骤如下；（1a）载体准备：将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸入到含有阴离子交联剂的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤，以除去水中的游离交联剂，得到吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物；（1b）游离磷脂酶D溶液制备：将磷脂酶D粉末加入乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后在25℃下离心10分钟收集上清液，得到游离磷脂酶D溶液；（1c）游离磷脂酶D的固定化：将吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在游离磷脂酶D溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后取出样口品，并用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，再将样品储存在4℃下冰箱中，得到固定化的磷脂酶D；（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为生物催化剂，先将L-丝氨酸与CaCl2加入到25℃水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，置于温度35～55℃恒温摇床400rpm反应0.5～2h，制备得到磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收固定化磷脂酶D以重复使用。其中：步骤（1a）中所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体为小于8mm3的颗粒状载体；步骤（1a）中所述的阴离子交联剂为聚乙二醇600，含有聚乙二醇600的水溶液浓度为10mg/ml；步骤（1b）中所述的游离磷脂酶D溶液为浓度为1～5mg/ml的游离磷脂酶D溶液；步骤（1b）中所述的乙酸钠缓冲液为20ml的100mM、pH6.0～8.0的乙酸钠缓冲液；步骤（1c）中所述的游离磷脂酶D溶液为10ml、pH6.0～8.0的游离磷脂酶D溶液；步骤（2）中所述的固定化的磷脂酶D的用量为0.1～0.3mg/ml反应体系；步骤（2）中使用的L-丝氨酸的浓度为20mM,CaCl2的浓度为15mM,L-丝氨酸与CaCl2加入的体积比为10：1；步骤（2）中所述的已溶解在乙酸丁酯中的磷脂酰胆碱浓度为6mM,使用的乙酸丁酯与L-丝氨酸的体积比为1:1；所述固定游离磷脂酶D的载体还包括ZnO纳米线/大孔二氧化硅复合载体、ZnO纳米线/介孔二氧化钛复合载体、ZnO纳米线/分子筛MCM复合载体、ZnO纳米线/分子筛SBA复合载体。此外，所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体的制备方法可参考李雪飞等人的报道（李雪飞，尚传洋，张瑞丰.ZnO纳米线／大孔SiO2复合物的制备及吸附性能[J].复合材料学报,2014,31(6):1490-1496），制备步骤如下：采用Zn（Ａc）2、聚乙二醇600、Ｈ2Ｏ三元混合溶液作为前驱物，通过100～２00℃温度范围内的两阶段加热使Zn（Ａc）2水解，再经过高温煅烧使ZnO晶种在介孔二氧化硅孔壁上形成；以锌氨络合物为锌源，在90℃下热分解后生成的Zn（OH）2沉积在孔道中，并在100℃下利用水热合成原位制备ZnO纳米线，通过改变三元前驱物组分用量以调节ZnO晶种的尺寸与分布，进而控制纳米线的形貌，最终获得直径为15～20nm的ZnO纳米线，其以无规线团形貌均匀填充于三维孔道中。基于上述构思的本专利技术用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，由于采用了ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物作为载体，固定游离磷脂酶D，确保制备得到的固定化的磷脂酶D具有较的高活性及稳定性，并以此作为合成磷脂酰丝氨酸的催化剂，极大地提高了工作可靠性及合成效率，而且固定化的磷脂酶D用过后还可以回收、重复利用，在确保合成产品质量的同时，还显著降低了生产成本，为实现PS大规模工业化生产提供了技术保障；而且在实践中证明，本专利技术将游离PLD固定在ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合载体上，固定化的PLD的负载量会随着pH7.0的游离PLD浓度的增加而增加，当游离PLD浓度达到4.0mg/ml时，负载量最大值可达150mg/g；经过固定化的PLD的酶活可达到172.3U/mg蛋白质，并且固定化后的PLD较游离酶相比展现出了更好的温度和pH稳定性；.固定化的PLD可高效的用于从PC催化合成PS，PS转化率在50℃、pH7.0条件下40分钟内达到96.4％；固定化的PLD具有相当好的重复性能，经过15次循环后，重复使用后PS转化率仍保持在85.6％。所以，本专利技术的方法科学且合理，反应条件温和、过程简单且绿色环保，可操作性强，解决了现有技术中的一大难题，有很强的实用性和可贵的经济性。附图说明图1是本专利技术实施例中PLD的浓度对固定化酶负载量的影响关系示意图；图2是本专利技术实施例中反应时间对生物催化合成PS的影响关系示意图；图3是本专利技术实施例中反应温度对生物催化合成PS的影响关系示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于固定化生物催化剂由以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体、固定游离磷脂酶D，制备得到的固定化的磷脂酶D充任，该方法包括如下步骤：/n（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D，制备得到固定化的磷脂酶D，步骤如下；/n（1a）载体准备：将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸入到含有阴离子交联剂的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤，以除去水中的游离交联剂，得到吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物；/n（1b）游离磷脂酶D溶液制备：将磷脂酶D粉末加入乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后在25℃下离心10分钟收集上清液，得到游离磷脂酶D溶液；/n（1c）游离磷脂酶D的固定化：将吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在游离磷脂酶D溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后取出样口品，并用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，再将样品储存在4℃下冰箱中，得到固定化的磷脂酶D；/n（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为生物催化剂，先将L-丝氨酸与CaCl...

【技术特征摘要】
1.一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于固定化生物催化剂由以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体、固定游离磷脂酶D，制备得到的固定化的磷脂酶D充任，该方法包括如下步骤：
（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D，制备得到固定化的磷脂酶D，步骤如下；
（1a）载体准备：将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸入到含有阴离子交联剂的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤，以除去水中的游离交联剂，得到吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物；
（1b）游离磷脂酶D溶液制备：将磷脂酶D粉末加入乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后在25℃下离心10分钟收集上清液，得到游离磷脂酶D溶液；
（1c）游离磷脂酶D的固定化：将吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在游离磷脂酶D溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后取出样口品，并用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，再将样品储存在4℃下冰箱中，得到固定化的磷脂酶D；
（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为生物催化剂，先将L-丝氨酸与CaCl2加入到25℃水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，置于温度35～55℃恒温摇床400rpm反应0.5～2h，制备得到磷脂酰丝氨酸。


2.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1a）中所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体为小于8mm3的颗粒状载体。


3.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1a）中所述的阴离子交联...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永志，
申请(专利权)人：南通厚元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32