DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法技术

本发明专利技术公开了一种DC‑CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，包括以下步骤：S1.采集外周血，得到灭活血浆；S2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到单个核细胞沉淀；S3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，悬浮细胞作CIK培养；S4.收获7D时的DC‑CTL细胞；S5.将DC‑CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用；S6.将S5得到的细胞沉淀冻存；S7.将S5中的上清培养液解冻；取出S6中冻存的细胞并快速解冻，混匀后离心得到细胞沉淀；S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1‑2百万活细胞/ml；S9.将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC‑CTL细胞，并取样做检测。

【技术实现步骤摘要】
DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法
本专利技术涉及细胞生物制品
，特别是涉及一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法。
技术介绍
DC-CTL免疫细胞临床研究是一种新的肿瘤患者个体化临床应用的技术，而免疫细胞培养又是免疫细胞临床研究的实验室阶段，其重要性和必要性已经在临床研究领域得到越来越重要的认识。对于临床研究来讲，免疫细胞应用于临床实践目前主要是从外周血提取分离单个核细胞，然后经过一定周期细胞培养就需要完成应用实践。DC-CTL细胞临床研究过程中，对肿瘤患者的筛选是严格准确的，随后随机分组做对照试验，评估处理试验组和对照组相应的试验数据，最后得出相应的试验结论。DC-CTL细胞培养过程都是一个连续的时间段，从患者外周血采集到制备完成的周期为14天，这就要求患者能够完全配合试验要求，要求在试验周期内患者能够确保试验按时进行。若肿瘤患者因个人等多种因素，很多时候无法确保能够完全按照临床试验步骤进行，就会导致整体试验减缓和影响，也直接影响到对照试验的准确性。这时候就需要废弃已经正在实验室培养的CTL细胞，再次进入临本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.采集外周血并分入离心管中，将离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆；/nS2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到血细胞悬液；将血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，并进行梯度离心，梯度离心后，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中，将装有白膜层的离心管离心，得到单个核细胞沉淀；/nS3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，使DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，悬浮细胞作CIK培养；/nS4.将已负载肿瘤抗原的DC与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D...

【技术特征摘要】
1.一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采集外周血并分入离心管中，将离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆；
S2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到血细胞悬液；将血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，并进行梯度离心，梯度离心后，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中，将装有白膜层的离心管离心，得到单个核细胞沉淀；
S3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，使DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，悬浮细胞作CIK培养；
S4.将已负载肿瘤抗原的DC与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞；
S5.将DC-CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用；
S6.将S5得到的细胞沉淀依次加入无血清培养液和无血清培养基冻存液，混匀后分装到冻存管中，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存；
S7.将S5中的上清培养液解冻；上清液培养液解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞并快速解冻，转移至新的离心管中，添加无血清培养液，混匀后离心得到细胞沉淀；
S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；
S9.将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC-CTL细胞，并取样做检测。


2.根据权利要求1所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：
S11.在无菌条件下，采集外周血，转移至含肝素钠的离心管内保存，冷链运输；
S12.消毒离心管外表面，转移至万级实验室的百级生物安全柜内；
S13.将外周血分入多个离心管并配平，将配平后的离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆。


3.根据权利要求1所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S2包括以下步骤：
S21.向S1中转移血浆层后余下的血细胞层加入生理盐水，混匀血细胞与生理盐水，得到血细胞悬液；
S22.将S21得到的血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，待结束后配平，配平后的离心管进行梯度离心；
S23.梯度离心后得到自上而下的血浆盐水层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中；
S24.将装有白膜层离心管离心，得到单个核细胞沉淀。


4.根据权利要求1-3任一项所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：
S31.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的悬浮细胞加入含γ-干扰素的无血清培养基，重悬细胞均匀转移至CIK细胞瓶中，竖瓶放置培养箱中培养；
S32.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的DC细胞加入含rh-GM-CSF、rhTL-4无血清培养基，培养瓶平躺放置培养箱中培养。


5.根据权利要求4所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S3还包括以下步骤：
S33.S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王知源，王广平，
申请(专利权)人：深圳市人和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44