一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法技术

本发明专利技术公开了一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法，属于微生物培养技术领域。本发明专利技术的方法包括种苗、采集感病叶片和菌种初繁、单孢系转接和扩繁等步骤，包括：使用90mm的一次性培养皿，在培养皿底部垫两张滤纸，加入3mL无菌水进行保湿。将病叶上的单孢子堆用移液枪离散至4μL的琼脂水溶液中，将混有夏孢子堆的溶液打在具有感病能力的NL895的嫩叶上，接种完成后置于温度为19℃，光周期为16h/24h的温室中进行培养，待其发病后在进一步扩繁至足量，保存至4℃冰箱待用。本发明专利技术采用室内接种的方法，对锈菌进行叶盘法培养，可获得分离的孢子堆，方法简单高效，为更好地研究杨树抗锈性提供纯化单一的菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法
本专利技术属于微生物培养
，具体地说，涉及一种杨树落叶松杨珊锈菌(Melampsoralaricipopulina)单孢扩繁方法。
技术介绍
杨树在全球有广泛栽培，因其生长快、适应性强，而且品种多，选育时间短，成为了防风固沙林、农田防护林、水土保持林和用材林的主要树种。但是随着大规模杨树人工林的发展，诸多病害随之流行，严重阻碍了杨树的生长。尤其是杨树叶锈病的发生，导致病害在杨树林地传播迅速，给杨树种植园带来巨大损失。导致杨树叶锈病的一种落叶松杨珊锈菌是世界杂交杨树上危害严重的一种病原菌，较成材而言，幼苗和幼树的受害更重，病症为叶背面出现淡黄色粉状物，且引起树苗提前落叶，严重降低其生长量，造成重大经济损失，并且造成树势减弱，使杨树抵御其他病虫害以及自然灾害的能力减弱。近几年，杨树锈病开始得到广泛的重视和研究，在研究其致病菌杨树落叶松杨珊锈菌时，为获得足量的样本，研究人员通常直接从染病的杨树叶片上刮取大量单孢子堆，由于这是一种混合菌系，对杨树落叶松杨珊锈菌分子遗传相关的研究极为不利，特别是研究其群体遗传时，所用的菌需要获得大量的纯菌系，而现有技术中还没有该病菌的人工大量扩繁其单孢系的良好方法，对该病菌许多研究具有很大的限制和影响。杨树锈病很多研究需要基于纯的菌系开展，该菌是转主寄主，0、I阶段寄生于落叶松属(Larix)，II、III阶段寄生于青杨派、黑杨派及以这两派为母本的杂交种上。并且只能在活的杨树叶片上存活和繁殖，扩繁单孢系比较困难，国内外也没有报道过落叶松杨珊锈菌单孢系的扩繁。因此现在亟需一套落叶松杨珊锈菌单孢扩繁体系，即得到纯化后的菌系。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，方便快捷高效。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，包括：挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌单孢子堆接种到健康的杨树叶上，繁殖后利用新的健康的杨树叶扩繁，最终获得大量的单孢系孢子粉。进一步地，所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，具体步骤包括：1)种苗：取三到四周的易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗进行炼苗；2)菌种初繁：摘取步骤1)得到的杨树苗的健康叶片，制成叶盘后用无菌水洗净，挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌的单孢子堆接种到叶盘上培养，每个叶盘上只接种一个单孢子堆；3)单孢系转接：待叶盘发病后，分别将每个叶盘上生长的孢子挑接到若干个新的叶盘上进行培养；4)按单孢系收集孢子粉；5)单孢系喷接扩繁：将收集的孢子粉配制成孢子悬液，以喷雾的形式接种到多个新的叶盘上继续培养，得到足够的孢子粉。进一步地，所述的叶盘的制备和接种后的培养方法为：摘取炼苗后的杨树苗的叶片，去除主脉切成2×2cm的小方块作为叶盘，无菌水洗净，使叶背面朝上置于培养皿中，培养皿底部预先加入滤纸和无菌水保湿，接种后用封口膜封好培养皿进行培养。进一步地，所述步骤2)中接种的具体操作为：在洗净的叶盘上均匀喷洒0.05％吐温20，然后将病叶上边缘清晰的单孢子堆用移液枪离散至4μL的0.1g/L琼脂水溶液中，再用移液枪将混有夏孢子堆的琼脂水溶液打在制备好的叶盘上。进一步地，所述步骤3)具体为：用10mL一次性注射器的针管对准叶盘上的孢子粉，轻轻刮取孢子粉收集到高温灭菌处理过的离心管内后加入1mL0.1g/L的琼脂溶液混匀，再分别转接到若干个新的叶盘上，接种前，新叶盘喷洒0.005％吐温20。进一步地，所述步骤5)中，孢子悬浮液的配制方法为：将步骤4)收集的孢子粉悬浮在含0.005％吐温20的0.1g/L琼脂溶液中，混合至浓度为2mg/mL的夏孢子悬浮液，使用喷壶使孢子悬浮液以喷雾的形式接种到健康的杨树叶盘上，进一步扩大单孢系的繁殖，得到足够的孢子粉。进一步地，步骤2)、3)和5)中，叶盘接种，后置于温度为19℃，光周期为16h/24h的温室中进行培养。进一步地，所述步骤3)和步骤5)，在获得的孢子量不够时，分别可重复1～5代。进一步地，步骤1)中所述易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗的品种为NL895。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的落叶松杨珊锈菌单胞系扩繁体系，生长的单孢子堆边缘清晰，没有其他污染的情况下，初繁成活率90％以上，喷接成功率95％。潜育期只有6-7天，接菌第7天开始产孢，8到10天产生大量孢子。因此该方法具有时间短、成活率高、菌系纯、产量大的特点，为落叶松杨珊锈病的相关研究提供了繁菌基础。附图说明图1为三到四周左右的NL895组培苗图；图2为感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树叶片图，左为叶片背面，右图为叶片正面；图3为菌种初繁图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。杨树苗：南林895(NL895，Populusdeltoides×P.euramericana)；琼脂水溶液制备：称取0.1g琼脂粉，先加100mL去离子水溶解，再定容至1L，放置灭菌锅中灭菌待用。实施例1：杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁1、种苗1)取三到四周左右的NL895组培苗(图1)，先开盖培养3天，再在培养基中加水没过培养基培养3天；2)选择口径为10cm花盆，将营养土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1，装满花盆；3)将装好土的花盆压平，浸水半天，待表层土微微湿润，选取长势好的NL895无菌苗移栽到土中炼苗。2、采集感病叶片：在江苏宿迁泗阳林场美洲黑杨林里选择感病较多的枝条上取两到三片完整的染病叶片(图2)；3、培养基准备使用90mm的一次性培养皿，在培养皿底部垫两张同等大小的滤纸，加入3mL无菌水进行保湿，选择生长周期3周以上的NL895植株，选取自顶芽往下数3-7片间完全展开的叶片，去除主脉切成2×2cm的小方块，无菌水洗净，叶背面朝上置于培养皿中，再喷洒0.005％吐温20；4、菌种初繁挑取两个感病叶片上边缘清晰的单孢子堆，每个叶盘上接种一个孢子堆。具体步骤如下：1)将接种用的移液枪的2.5μL枪头进行灭菌处理，冷却。2)将病叶上的单孢子堆用移液枪(Eppendorf公司)挑取，反复吹打离散至装有4μL的琼脂水溶液单排管中，再用移液枪将混有夏孢子堆的溶液吸取打在制备好的叶盘上，每个叶盘上只接种一个孢子堆的孢子，每个培养皿放置接种一个孢子堆的叶盘，接种完盖好培养皿盖，用封口膜封好培养皿。由于夏孢子堆为无性繁殖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，其特征在于，包括：挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌单孢子堆接种到健康的杨树叶上，繁殖后利用新的健康的杨树叶扩繁，最终获得大量的单孢系孢子粉。/n

【技术特征摘要】
20200611 CN 202010532798X1.一种杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，其特征在于，包括：挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌单孢子堆接种到健康的杨树叶上，繁殖后利用新的健康的杨树叶扩繁，最终获得大量的单孢系孢子粉。


2.根据权利要求1所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，其特征在于，具体步骤包括：
1)种苗：取易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗进行炼苗；
2)菌种初繁：摘取步骤1)得到的杨树苗的健康叶片，制成叶盘后用无菌水洗净，挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌的单孢子堆接种到叶盘上培养，每个叶盘上只接种一个单孢子堆；
3)单孢系转接：待叶盘发病后，分别将每个叶盘上生长的孢子挑接到若干个新的叶盘上进行培养；
4)按单孢系收集孢子粉；
5)单孢系喷接扩繁：将收集的孢子粉配制成孢子悬液，以喷雾的形式接种到多个新的叶盘上继续培养，得到足够的孢子粉。


3.根据权利要求2所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，其特征在于，所述的叶盘的制备和接种后的培养方法为：摘取炼苗后的杨树苗的叶片，去除主脉切成2×2cm的小方块作为叶盘，无菌水洗净，使叶背面朝上置于培养皿中，培养皿底部预先加入滤纸和无菌水保湿，接种后用封口膜封好培养皿进行培养。


4.根据权利要求2所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，其特征在于，所述步骤2)中接种的具体操作为：在洗净的叶盘上均匀喷洒...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹佟明，周妍，戴美丽，李淑娴，戴晓港，李小平，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32