深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法技术

本发明专利技术公开了一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，属于生物技术领域，包括以下连续步骤：(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，过滤，收集真菌孢子。本方法相比常规方法能够快速、高效、准确的收集侵袭性真菌感染的病原菌，提高培养的阳性率。

【技术实现步骤摘要】
深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法。
技术介绍
真菌是自然环境中广泛分布的微生物，也是人类皮肤和粘膜常见的共生菌。然而，在机体的免疫系统受损或功能屏障破坏的情况下，真菌就会侵入粘膜、内脏器官及深部组织，在特定条件下，可以播散引起全身感染，造成真菌血症和深部组织感染，有较高的致死率。目前发现的真菌有150万种，其中约500种是致病菌。近三十年来，由于恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病、器官移植患者的增多，这些患者免疫力低下，又长期使用广谱抗生素、激素类药物及接受创伤性医疗等因素，侵袭性真菌感染的发病率及死亡率明显提升。另外，侵袭性真菌感染发病多隐匿，患者临床表现多无特异性，其微生物病原学的早期、准确诊断对于临床显得尤为重要。目前真菌感染的病原学诊断的手段中，组织形态学染色及影像学检查阳性率低，真菌抗原及抗体检测特异性差，基因扩增技术由于受标本、扩增引物、扩增条件等因素限制，结果多不稳定，且微生物室常规真菌培养耗时长、时效性较差，难以满足临床早期诊治的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，能够快速、高效、准确的收集侵袭性真菌感染的病原菌。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，包括以下步骤：(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，收集真菌孢子。优选的，所述步骤(c)中离心的条件为：5000rpm离心5min；所述高速离心的条件为：14000rpm离心10min。优选的，所述深部真菌感染标本为深部真菌感染组织、深部真菌感染体液以及肺泡灌洗液中的一种。优选的，所述深部真菌感染组织的处理方法为：在无菌条件下，对深部真菌感染组织剪切研磨，将剪切研磨后的组织混合物经300目尼龙网过滤，使用0.01mol/LPBS溶液洗涤、过滤，之后转移至离心管中，加入5mL红细胞裂解液重悬，离心，弃上清液，将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。优选的，所述离心的条件为：1500rpm离心15min。优选的，所述深部真菌感染体液的处理方法为：取血液、脑脊液、胸水、腹水、胆汁以及引流液中的一种，离心后，弃上清液，采用细胞针将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。优选的，所述离心条件为4000rpm离心5min。优选的，所述肺泡灌洗液的处理方法为：取20μL肺泡灌洗液做细胞涂片，通过显微镜筛选出合格的标本；将合格的标本经300目尼龙网过滤，过滤液转移至离心管中离心，弃上清液，用细胞针将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。优选的，所述合格标本为上皮细胞的总数占比不超过3％，红细胞的总数占比不超过10％。优选的，所述离心的条件为：1500rpm离心15min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术着重于可能发生深部真菌感染的组织、无菌体液、肺泡灌洗液等标本处理后收集真菌感染细胞，能实现真菌感染细胞的快速、高效收集，提高培养的阳性率。(2)将阳性培养物直接离心并通过生物膜过滤收集真菌孢子以用于快速鉴定。附图说明图1为本专利技术的流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1如图1所示，深部真菌感染组织中收集真菌孢子的方法包括以下步骤：(a)预处理：对深部感染组织进行取材，取材体积为1×1×2cm，将取材的标本放入预冷的无菌培养皿中；在生物安全柜中，使用12cm无菌外科剪剪碎组织，并在冰浴条件下，于2mL玻璃研磨器中反复研磨；将研磨好的组织混合物经300目尼龙网过滤，这个操作能够过滤细胞膜以及大量红细胞，保证原核或真核病原体的收集；过滤完成后使用0.01mol/LPBS溶液反复洗涤过滤，并转移至无菌20mL离心管中，向离心管中加入5mL红细胞裂解液(ACKLysisBuffer)，红细胞裂解液能够在不损伤有核细胞的前提下去除红细胞；然后在4℃、1500rpm的条件下离心15min，弃上清液，得到沉淀的混合物。(b)真菌培养：使用7号细胞针将上述沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养。(c)收集真菌孢子：取5mL的真菌血培养瓶中呈阳性的混合物加入到20mL无菌的离心管中，在5000rpm的条件下离心5min，得到沉淀物，然后将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，并在14000rpm的条件下高速离心10min，收集真菌孢子。在本实施例中，0.01mol/LPBS溶液的制备方法为：称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾于烧杯中，加蒸馏水至1000ml，搅拌溶解，并调节PH值为7.4。实施例2如图1所示，深部真菌感染体液中收集真菌孢子的方法包括以下步骤：(a)对深部真菌感染体液处理：取3ml血液，在4000rpm的条件下离心15min后，收集浓缩后含有真菌的混合物。(b)真菌培养：采用7号细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养。(c)收集真菌孢子：取5ml的真菌血培养瓶中呈阳性的混合物加入到20mL无菌的离心管中，在5000rpm的条件下离心5min，得到沉淀物，然后将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，并在14000rpm的条件下高速离心10min，收集真菌孢子。实施例3如图1所示，肺泡灌洗液中收集真菌孢子的方法包括以下步骤：(a)对肺泡灌洗液处理：取20μL肺泡灌洗液做细胞涂片，通过显微镜观察筛选出合格的标本，所述合格的标本为上皮细胞的总数占比为2％，红细胞的总数占比为6％；将合格的标本经300目尼龙网过滤，去除脱落上皮细胞及粘液，收集所有包含真菌的肺泡灌洗液至20ml离心管中；在4℃，1500rpm的条件下离心15分钟，弃上清液，收集含有真菌的混合物。(b)真菌培养：采用7号细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养。(c)收集真菌孢子：取5ml的真菌血培养瓶中的混合物加入到20mL无菌的离心管中，在5000rpm的条件下离心5min，收集沉淀物，然后将上述沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，并在14000rpm的条件下高速离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；/n(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；/n(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，收集真菌孢子。/n

【技术特征摘要】
1.一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；
(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；
(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，收集真菌孢子。


2.根据权利要求1所述的深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，其特征在于：所述步骤(c)中离心的条件为：5000rpm离心5min；所述高速离心的条件为：14000rpm离心10min。


3.根据权利要求1所述的深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，其特征在于：所述深部真菌感染标本为深部真菌感染组织、深部真菌感染体液以及肺泡灌洗液中的一种。


4.根据权利要求3所述的深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，其特征在于：所述深部真菌感染组织的处理方法为：在无菌条件下，对深部真菌感染组织剪切研磨，将剪切研磨后的组织混合物经300目尼龙网过滤，使用0.01mol/LPBS溶液洗涤、过滤，之后转移至离心管中，加入5mL红细胞裂解液重悬，离心，弃上清液，将沉淀的混合物转移至真菌血培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉串，胡伟华，余嘉伟，包秀玲，
申请(专利权)人：杭州同创医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33