检测受体寡聚化制造技术

本发明专利技术提供了检测细胞膜表面分子形成寡聚复合物的方法。这些方法使用各自与细胞表面分子特异结合的标记探针对并裂解探针。标记的探针包括与第一个结合化合物经可裂解键连接的分子标记，裂解探针包括第二个结合剂和裂解诱导部分，当后者位于规定的键附近时可以裂解键。两个探针与已形成寡聚复合物的细胞表面分子结合导致分子标记从结合化合物中释放，提供复合物形成的一种检测指标。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测量细胞表面分子特别是细胞表面膜受体寡聚化的方法，。
技术介绍
细胞表面膜成分的相互作用在正常生理学和疾病状态下对细胞外信号转送到细胞起重要的作用。特别地，许多类型的细胞表面受体经过二聚作用或寡聚化与细胞外活动或信号，如配体-受体结合转导为细胞反应，如增殖、增加或减少基因表达，或类似反应相关联，如George等人，Nature Reviews Drug Discovery，1808-820(2002)；Mellado等人，Ann.Rev.Immunol.，19397-421(2001)；Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；Yarden，Eur.J.Cancer，37S3-S8(2001)。这种信号转导活动在疾病如癌症中的作用已成为认真研究的对象，并导致开发了数种新药和候选药物，如Herbst和Shin，Cancer，941593-1611(2002)；Yarden和Sliwkowski，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2127-137(2001)。很多种技术已用于研究细胞表面受体的二聚作用和寡聚化，包括免疫沉淀反应、化学交联、生物发光共振能量传递(BRET)、荧光共振能量传递(FRET)和类似技术，如Price等人，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)；McVey等人，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等人，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，973684-3689(2000)。不幸地，尽管受体二聚作用和寡聚化在信号转导过程中很重要，但检测这种相互作用的技术难以应用，缺少灵活性，并缺少灵敏性。缺少方便和敏感的分析细胞表面分子寡聚化的技术大大增加了根据这种现象开发新的治疗或诊断方法的难度。鉴于上述原因，检测或测量细胞表面分析物二聚作用或寡聚化的方便、敏感和成本划算的技术的实用性将提高许多领域的技术，在这些领域中这种测量正在变得日益重要，包括生命科学研究、医学研究和诊断学、药物专利技术，等等。专利技术概述本专利技术提供了检测和/或测量膜-结合分子寡聚物的方法，特别是细胞膜受体的二聚体和寡聚物。在一个方面，本专利技术的方法使用至少两个对二聚体或寡聚物的不同成员特异的试剂一个成员，在此指裂解探针，具有裂解诱导部分，可导致其紧邻的敏感键的裂解；另一个成员，在此指结合化合物，具有一个或多个通过可被裂解诱导部分裂解的键连接的分子标记。按照本方法，只要这种不同的成员形成二聚体或寡聚物，可裂解键就被带入裂解诱导部分的有效裂解近端，使得分子标记能被释放。然后分子标记被从反应混合物中分离并量化以供二聚作用或寡聚化的测量。在另一个方面，本专利技术的方法包括以下步骤提供对多个受体类型的第一个受体类型特异的裂解探针，所述裂解探针具有带有效近端的裂解诱导部分；提供一个或多个各自对多个不同的第二个受体类型特异的结合化合物，每个结合化合物具有一个或多个通过可裂解键连接的分子标记，不同结合化合物的分子标记具有不同的分离特性；混合裂解探针、一种或多种结合化合物和含第一和第二个受体类型的细胞膜，使裂解探针和一种或多种结合化合物与其各自的受体特异地结合，一种或多种结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端使分子标记被释放；分离和鉴定释放的分子标记以测定细胞膜中有或无受体类型寡聚化或寡聚化的量。在另一个方面，本专利技术提供了细胞膜中膜相关分析物的二聚体的检测方法，该方法包括以下步骤提供对二聚体的第一个膜相关分析物特异的结合化合物，所述二聚体含有第一个膜相关分析物和第二个膜相关分析物，所述结合化合物具有一个或多个各自通过可裂解键连接的分子标记，所述一个或多个分子标记各自具有分离特性；提供对第二个膜相关分析物特异的裂解探针，所述裂解探针具有带有效近端的裂解诱导部分；混合裂解探针、结合化合物和细胞膜，使裂解探针特异地与第一个膜相关分析物结合，结合化合物特异地与第二个膜相关分析物结合，使得结合化合物的可裂解键处于裂解诱导部分的有效近端，因此分子标记被释放；分离和鉴定释放的分子标记以测定细胞膜中有或无二聚体或二聚体的量。在另一个方面，本专利技术提供了描绘细胞表面上众多受体类型中二聚体发生频度的方法。在另一个方面，本专利技术包括实现本专利技术方法的试剂盒。在一个实施例中，本专利技术的试剂盒包括一种或多种结合化合物和裂解探针。在另一个实施例中，这一种或多种结合化合物和裂解探针各自对含二聚体受体的不同抗原决定簇特异，所述受体选自Herl、Her2、Her3和Her4。更特别地，这一种或多种结合化合物和裂解探针各自对以下二聚体的不同抗原决定簇特异Her1的二聚体、Her2的二聚体、含Her1和Her2的二聚体、含Her1和Her3的二聚体和含Her2和Her3的二聚体。本专利技术提供了检测或测量膜相关分析物二聚作用或寡聚化的方法，比当前通用的技术具有几个优势，包括但不限于，(1)检测和/或测量从检验混合物中分离的分子标记，大大降低了背景并显著灵敏性更高；和(2)使用特别设计的易于分离和检测的分子标记，从而提供了方便的多路性能。附图描述附图说明图1A和1B图解地说明本专利技术方法的一个实施例，测量生物学细胞表面存在受体二聚体。图2A-2E图解地说明本专利技术方法的一个实施例，描绘多数受体类型二聚体的发生频度。图3A-3F图示氧化不稳定键及其各自由单态氧介导的裂解反应。图4A4B图示可用于构建本专利技术分子标记的荧光素衍生物。图5A图示结合标记到抗体上形成标记探针的一般方法学，和用单态氧得到标记探针的反应，以产生亚磺酸部分作为释放的标记。图5B概括了合成荧光素标记的分子标记的化学。图6A-J显示已被设计和合成的标记结构。图7A-D图示图6中显示的标记部分的化学合成。图8A-8C图解地说明微流体学装置以实现电泳分离分子标记的步骤。图9A-9E图示用本专利技术的方法对细胞溶解产物检验受体杂二聚体的数据。图10A-10C图示用本专利技术的方法对组织样本检验受体杂二聚体的数据。图11A和11B图示本专利技术的试验检测Her1同型二聚体和磷酸化作用的数据。图12显示本专利技术试验的数据，显示两个不同细胞系上Her2二聚体集合。图13A-13B显示本专利技术的试验探测细胞上Her1和Her3杂二聚体的数据。定义″抗体″是指与另一个分子的特定空间和极性结构特异地结合，并因此定义为与之互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆，并能够用本领域熟知的技术制备，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变型，所述核苷酸序列至少编码与天然抗体特异结合所需的氨基酸序列。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类型和亚型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。抗体片段可包括Fab、Fv和F(ab′)2、Fab′，和类似片段。此外，适当时可以使用免疫球蛋白集合体、聚合体和共扼物或其片段，只要维持对特定多肽的结合亲合力。″抗体结合组合物″是指含有一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测细胞膜中膜相关分析物二聚体的方法，该法包括以下步骤：提供对二聚体中第一个膜相关分析物特异的结合化合物，所述的二聚体包括第一个膜相关分析物和第二个膜相关分析物，结合化合物具有一个或多个分子标记，每个都通过一个可裂解键附着在其上 ，所述的一个或多个分子标记每个都具有一种分离特性；提供对第二个膜相关分析物特异的裂解探针，裂解探针含有一个具有有效近端的裂解诱导部分；将裂解探针，结合化合物和细胞膜混合，这样裂解探针与第一个膜相关分析物特异结合，结合化合物与 第二个膜相关分析物特异结合，使结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端之内，使分子标记可被释放；和分离和鉴定被释放的分子标记以确定在细胞膜中是否存在二聚体或二聚体的含量。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张睴波英，施一宁，S皮达帕斯伊，R杜瓦，S辛格，
申请(专利权)人：阿克拉若生物科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]