一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用制造技术

本发明专利技术公开了香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用，milRNAs及其前体的序列分别如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示。发明专利技术人发现侵染寄主后的香蕉枯萎病菌中上述milRNAs显著提高；利用同源重组的方法将该milRNAs的前体从香蕉枯萎病菌中敲除，获得的缺失突变体的致病力显著降低。本发明专利技术证实了milRNAs是香蕉枯萎病菌具有致病力所必需的。本发明专利技术有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病机制，为开发杀菌剂提供了靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用。
技术介绍
香蕉，主要种植在热带地区，是世界贸易量最大的水果，也是联合国粮农组织认定的发展中国家继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。我国是世界第二大香蕉生产国，也是全球香蕉的主要消费国，如今香蕉已经成为我国热带亚热带地区农业支柱性产业之一。然而，被人们称为“香蕉癌症”的香蕉枯萎病正严重威胁着世界香蕉产业的发展，造成的损失已超过4亿美元，制约着全球范围内的香蕉生产与贸易。香蕉枯萎病又称香蕉黄叶病，起源于东南亚，1910年在中南美洲的巴拿马大流行，因此又被称为巴拿马病(PanamaDisease)，其蔓延快，根治难。香蕉枯萎病已在世界范围内的香蕉产区蔓延，少有地区能够幸免，并且还在不断蔓延至未发病的香蕉种植地区。我国香蕉枯萎病的研究大多集中在南方，针对其病原菌致病机理的研究相对滞后，物理化学防治效果不佳。近年来研究人员在动植物体内发现microRNA(miRNA，长度约22nt的内源性非编码小RNA)是重要的转录后调控因子，通过与靶基因编码区或5’和3’非翻译区结合对靶基因进行切割从而抑制靶基因的翻译，参与多种生物学过程。在真菌中，也存在与动植物miRNA结构相似的非编码小RNA，被称之为microRNA-likeRNA(milRNA)。在粗糙脉孢菌中，已报道至少存在4种类型的milRNAs，其中一种milRNA与Argonaute(AGO)蛋白(在香蕉枯萎病菌中由FoQDE2基因编码)密切相关，其合成不需要Dicer酶切割，但依赖AGO的催化活性，AGO取代了Dicer加工milRNA前体并去除非功能链，最后产生成熟miRNA。课题组前期研究结果表明，与野生型菌株相比，香蕉枯萎病菌FoQDE2基因敲除突变体的致病力显著降低(林漪莲.香蕉枯萎病菌miRNA合成相关基因FoQDE2的鉴定和功能分析[D].广州:华南农业大学，2018.)。为了进一步探究FoQDE2基因敲除突变体致病力下降的原因，我们通过高通量测序的方法寻找依赖FoQDE2合成的milRNA，试图通过分析鉴定milRNA的功能解析其在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用机制。而且香蕉枯萎病菌致病相关milRNA的鉴定及功能解析不仅为香蕉枯萎病防控提供了新的作用靶点，还为深入研究milRNA在香蕉枯萎病菌中的作用机制奠定基础，具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，其生物合成与Argonaute蛋白密切相关。本专利技术的另一目的在于提供上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的前体。本专利技术的再一目的在于提供上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，包括由同一前体产生的两个milRNA：milR109和milR123。所述的milR109的核苷酸序列如下所示：ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA。所述的milR123的核苷酸序列如下所示：ACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCG。上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的前体，核苷酸序列如下所示：CTCGGGCCCTGGTTGCGTTGGAGTCACAGCTCGTCCGATTGTGCGAGATCTGCACTGTATGTCTTGGTATGAACGGGGTTCATATCATTGCATACAGTGTCGAACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCGACACCAACGCAACCAGGACTTTGATGGCCTTCGCACACTTGACACACCACACACACTCACTCTCTCTTTATCGCACTCATTGAAATGCCTGGGAGGATTGACTTGACTTGACTTGATTTGGCTTGGACTTGGACTT。上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。所述的milRNA及其前体缺失能够使香蕉枯萎病菌致病力下降。上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体在防治香蕉枯萎病中的应用。所述的香蕉枯萎病由香蕉枯萎病菌导致。上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体作为植物病害防治药物的靶标的应用。所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，通过阻断或抑制香蕉枯萎病菌中上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的表达。阻断或抑制香蕉枯萎病菌中致病相关milRNAs的表达的药剂在制备药物中的应用。所述的药物用于防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。所述的香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，FOC)4号生理小种。所述的尖孢镰刀菌古巴专化型的野生型菌株名称为XJZ2。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术通过扩增香蕉枯萎病菌致病相关的milR109和milR123前体两侧的同源片段，同时融合潮霉素磷酸转移酶基因，构建milR109和milR123前体缺失突变体。试验证明，相比野生型菌株XJZ2，缺失突变体的致病力显著降低；侵染寄主后的香蕉枯萎病菌中milR109和milR123显著提高。本专利技术证实了milRNAs是香蕉枯萎病菌具有致病力所必需的，有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病机制，为开发杀菌剂提供靶标。附图说明图1为实施例1中，测序处理并分析筛选得到的sRNA表达差异统计图；其中，以y轴(FoQDE2基因缺失突变体中sRNA表达量)与x轴(XJZ2中sRNA表达量)的比值做散点图分析，在直线y＝x以上的圆点表示在FoQDE2基因缺失突变体中表达量上调，以下表示在FoQDE2基因缺失突变体中表达量下调。图2为实施例1中，测序处理并分析筛选得到的sRNA长度统计结果与开头碱基偏好性统计图；其中，a为测序分析结果中16-40ntreads分布情况；b为开头碱基占比情况；c为20-24nt开头碱基占比情况。图3为预测的milRNAs(milR109和milR123)前体二级结构图。图4为实施例3中milRNAs定量检测结果图；其中，a为milRNAs在其合成相关通路基因缺失突变体菌株中的表达量检测情况；b为接种寄主后侵染36h后milRNAs的表达情况。图5为实施例4milRNAs序列RT-PCR结果电泳图。图6为实施例5前体敲除突变体的PCR验证结果图；其中，引物HPH-F/HPH-R验证结果：泳道1-3为敲除突变体ΔmilR109-6、ΔmilR109-8、ΔmilR109-10，片段大小均为518bp，4为阳性对照XJZ2，5为清水阴性对照；引物milR109-JCF1/HPH-R验证结果：泳道1-3分别为敲除突变体ΔmilR109本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，其特征在于，包括同一前体产生的两个milRNA：milR109和milR123；/n所述的milR109的核苷酸序列：ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA；/n所述的milR123的核苷酸序列：ACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCG。/n

【技术特征摘要】
1.一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，其特征在于，包括同一前体产生的两个milRNA：milR109和milR123；
所述的milR109的核苷酸序列：ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA；
所述的milR123的核苷酸序列：ACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCG。


2.权利要求1所述的香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的前体，其特征在于，核苷酸序列如下所示：
CTCGGGCCCTGGTTGCGTTGGAGTCACAGCTCGTCCGATTGTGCGAGATCTGCACTGTATGTCTTGGTATGAACGGGGTTCATATCATTGCATACAGTGTCGAACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCGACACCAACGCAACCAGGACTTTGATGGCCTTCGCACACTTGACACACCACACACACTCACTCTCTCTTTATCGCACTCATTGAAATGCCTGGGAGGATTGACTTGACTTGACTTGATTTGGCTTGGACTTGGACTT。


3.权利要求1和2所述的香蕉...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏慧，苑曼琳，王猛，毕芸田，姜子德，习平根，李华平，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44