一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用制造技术

本发明专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，所述黄酮类化合物为泽兰黄酮‑7‑(6’’‑丙二酰)葡萄糖苷‑4'‑葡萄糖苷。本发明专利技术还公开了一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，以泽兰黄酮‑7‑(6’’‑丙二酰)葡萄糖苷‑4’‑葡萄糖苷为指示性物质，当其在蜂花粉中含量介于500‑800 mg/kg时，可将其判断为真实的玫瑰蜂花粉；当其在蜂花粉中的含量低于500 mg/kg，则将其判定为其它类型的蜂花粉或掺假玫瑰蜂花粉。本发明专利技术提供的方法还具有简单、准确等优点，便于操作和推广，对保护玫瑰蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂产品消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用
本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用。
技术介绍
蜂产品是目前一种常见的食品类型，按其来源和形成状态的不同可以分为三大类：蜜蜂的采制物，如蜂蜜、蜂花粉和蜂胶等；蜜蜂的分泌物，如蜂王浆、蜂毒和蜂蜡等；蜜蜂自身生长发育各类虫态的躯体，如蜜蜂幼虫和蜜蜂蛹等。其中，蜂花粉是蜜蜂采集粉源植物的花粉，与自身分泌物相混合，加工成花粉团，储存在蜂巢中。蜂花粉中含有丰富的蛋白质、维生素、酚酸黄酮和矿物质等对身体有益的物质，是蜜蜂蛋白质食物的主要来源，是人们美容、养生、保健的重要天然食品之一，深受人们喜爱。由于粉源植物的不同，蜂花粉的色泽、口感和功效存在较大的差异，其中能够形成商品化的蜂花粉种类有：油菜、茶花、荞麦、玫瑰、玉米、荷花以及来源不清晰的杂花粉等。其中，玫瑰蜂花粉因具有良好的保健功效，最为受消费者喜爱。由于玫瑰蜂花粉产量有限，售价较高，市场供不应求，不良商家为了谋取高额利润，采用掺假售假等方式欺骗消费者。当前，尚未有关于玫瑰蜂花粉真实性的标准和鉴别方法，产品的真实性主要基于企业的自律和信誉。如何维护玫瑰蜂花粉的真实性，保护蜂农和消费者的权益成为广大蜂产品行业从业者的共识。玫瑰蜂花粉中含有丰富的内源性物质，其中以具有药理活性的酚酸黄酮为代表，但是有关玫瑰蜂花粉中的酚酸黄酮的种类和化学结构，鲜有文献报道。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，具体为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用。本专利技术以玫瑰蜂花粉中的特征性内源性物质泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为其标志物，用来评价玫瑰蜂花粉的真实性。本专利技术首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的玫瑰蜂花粉以及其它常见的蜂花粉进样分析。实验结果表明玫瑰蜂花粉在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，其色谱保留时间为7.50min，精确质量数为m/z727.17162，但是该物质的化学结构尚不清晰。为了明确该物质的化学结构，本专利技术从玫瑰蜂花粉中提取纯化了该物质，获得该物质的高纯度对照品。基于核磁共振(NMR)和高分辨质谱提供的数据，明确了该物质的化学结构为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷（Nepetin-7-(6''-Malonyl)Glucoside-4'-Glucoside），化学结构如下所示：。基于获得的对照品，本专利技术采用LC-MS初步建立了花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的准确定量分析方法。另外，本专利技术从玫瑰蜂花粉的各产地共采集了20余份花粉样本，样本经前处理之后，由开发的LC-MS方法进样分析，结果发现玫瑰蜂花粉中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量较为稳定为500-800mg/kg。而其它品种的蜂花粉中，该物质的含量很低，甚至检测不到。因此，可以将泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷作为玫瑰蜂花粉的特征性物质，用于玫瑰蜂花粉的真实性鉴别及纯度评价。本专利技术进一步提出一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，以泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷为特征性标志物对蜂花粉样本进行检测；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量介于500-800mg/kg，判断所述蜂花粉样本为玫瑰蜂花粉；若所述蜂花粉样本中所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量低于500mg/kg，判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假玫瑰蜂花粉。作为优选，通过加入泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的空白蜂花粉（油菜蜂花粉，该花粉中不含有此物质）确认泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂花粉样本中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的峰面积推算其含量。作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap（超高液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱）或LC-MS/MS检测蜂花粉样本。作为优选，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z727.17162([M+H]+)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；优选泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷色谱峰的保留时间为7.50min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。此外，为了提高玫瑰蜂花粉的鉴别能力，泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有其主要的碎片离子，本专利技术进一步发现了其特征碎片离子：m/z565.11880、m/z479.11840和m/z317.06558，其精确质量数的误差应当小于10ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷对照品的情况，依然可以通过液相色谱串联质谱法来判定蜂花粉样本中是否含有玫瑰蜂花粉，并可积分母离子峰面积用于玫瑰蜂花粉含量的计算。作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0.0-2.0min，5%的流动相B；2.0-7.0min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0min，95%的流动相B；18.0-20.0min，5%的流动相B。作为优选，液相的流速为0.30mL/min。作为优选，进样量为5.0µL。作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速45arb；辅助气的流速10arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lensRFlevel设为60V；离子源的温度350℃；作为优选，采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2，其中FullMS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGCTarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：80-1200Da；Spectrumdata：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGCTarget：1e5；MaximumIT：50ms；Loopcount：2；Isolationwindow：2.0Da；NCE：35eV；Spectrumdata：Centroid；在ddsettings中，MinimumAGC：8.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种黄酮类化合物作为玫瑰蜂花粉特征性标志物的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物为泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构如下：


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2.一种玫瑰蜂花粉的真实性评价方法，其特征在于，以泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷为特征性标志物对蜂花粉样本进行检测；若所述蜂花粉样本中泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量介于500-800mg/kg，判断所述蜂花粉样本为玫瑰蜂花粉；若泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的含量低于500mg/kg，则判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假玫瑰蜂花粉；所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的化学结构式如下：


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3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测所述蜂花粉样本。


4.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z727.17162[M+H]+准分子离子峰，其精确质量数的误差小于5ppm；所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷色谱峰的保留时间为7.50min，保留时间允许的偏差小于±0.3min，所述泽兰黄酮-7-(6’’-丙二酰)葡萄糖苷-4’-葡萄糖苷的MS/MS图谱中含有以下一个或多个碎片离子蜂，m/z565.11880、m/z479.11840和m/z317.06558，其精确质量数的误差小于10ppm。


5.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对所述蜂花粉样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2min，5%的流动相B；1.2-7min，5-30%的流动相B；7-14min，30-95%的流动相B；14-18.0min，95%的流动相B；18.0-20.0mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，张玉豪，张金震，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11