生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用，属于生物标记及成像技术领域。本发明专利技术提供的稀土探针内含有四嗪基团，与Tb

【技术实现步骤摘要】
生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用
本专利技术属于生物标记及成像
，特别涉及基于生物正交反应且具有时间分辨荧光响应性探针及其制备方法，具体涉及生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用。
技术介绍
生物正交反应是一类能够在活体细胞内不干扰生物自身生化反应条件下进行的化学反应，主要包括有含有叠氮与炔基或磷酸基团、四嗪与烯烃或者反式环辛烯等，具有选择性高、反应迅速等特点。因此，发展生物正交反应探针在拓宽生物应用方面是十分必要的。目前，该反应结合有机荧光小分子探针及其成像技术已广泛应用于生物标记及其成像领域。其中，对于糖蛋白的标记和成像在肿瘤细胞转移的基础研究、生物医学诊断方面具有重要意义。细胞膜表面的糖蛋白(Glycans)、糖磷脂作为细胞膜重要组成部分，在许多生理过程中扮演着非常重要的角色，如癌症细胞的异常增殖与转移、细胞生长、免疫保护、病毒的复制、炎症的产生等。目前，对于糖蛋白的标记和成像方法主要是有机荧光小分子探针及纳米荧光材料等。【参见：a)J.R.Ha,L.Hao,G.Venkateswaran,Y.H.Huang,E.Garcia,S.Persad,Exp.CellRes.2014,321,153–166；b)N.Khidekel,S.B.Ficarro,E.C.Peters,L.C.HsiehWilson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004,101,13132–13137；c)W.Morelle,J.C.Michalski,Nat.Protoc.2007,2,1585–1602.】此类方法的主要缺点是破坏了糖蛋白的结构。近些年，以Diels-Alder反应为主的生物正交反应荧光探针在分子识别和医学诊断等领域受到广泛的关注，因为凭借该反应具有操作简单、反应物易于合成、特异性高等优点。【a)O.T.Keppler,R.Horstkorte,M.Pawlita,C.Schmidt,W.Reutter,Glycobiology2001,11,11R–18R；b)D.H.Dube,C.R.Bertozzi,Curr.Opin.Chem.Biol.2003,7,616–625；c)T.-L.Hsu,S.R.Hanson,K.Kishikawa,S.K.Wang,M.Sawa,C.H.Wong,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007,104,2614–2619；d)J.Du,M.A.Meledeo,Z.Wang,H.S.Khanna,V.D.Paruchuri,K.J.Yarema,Glycobiology2009,19,1382–1401；e)S.Stairs,A.A.Neves,H.Y.A.Wainman,H.Ireland-Zecchini,K.M.Brindle,F.J.Leeper,ChemBioChem2013,14,1063–1067.】但此类探针主要缺点是：1)铜离子的毒性较大；2)荧光背景大，特别是生物细胞和组织的自发荧光，不利于大规模推广。因此，开发具有低毒、时间分辨特性的荧光探针在实际应用中仍然具有重要的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。该稀土探针以快速准确、灵敏无毒的实现对肿瘤细胞的细胞膜成像。本专利技术的另一目的在于提供上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备方法。其制备是以7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸为原料，通过偶联等过程得到含有四嗪官能团的中间体，此中间体进一步与二乙基三胺五乙酸、六水氯化铽进行螯合获得生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。本专利技术的再一目的在于提供上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，其结构式如式Ⅰ所示：其中，式Ⅰ中X为一类连接基团，包括酰胺键、酯基等，且连接基团之间的间距需小于等于10nm，以保证荧光共振能量转移的有效发生；现以X＝X1或X2为例；上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备方法，包括如下步骤：(1)IX1中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺在N,N-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂并用硅胶色谱分离得含有四嗪官能团的红色固体；(2)IX2中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺反应的产物和4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐反应的产物在N,N-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂，硅胶色谱分离得到含有四嗪官能团的红色固体；(3)IX1或IX2制备：将步骤(1)或(2)得到的含有四嗪官能团的红色固体与二乙基三胺五乙酸在二甲基亚砜中搅拌，用乙醚沉淀干燥，再在二甲基亚砜/水(体积比，1:1)中与六水氯化铽搅拌反应，乙醚沉淀干燥得稀土探针IX1或稀土探针IX2，即生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。步骤(1)、(2)中所述的对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺；所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸的摩尔比为5～10：5～10：1；优选为5：5：1；优选的，步骤(1)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺的摩尔比为2：2～5；进一步为1：1；优选的，步骤(2)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺反应的产物和4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐反应的产物的摩尔比为1：1～5；进一步为1：1；优选的，步骤(2)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺的摩尔比为1：1～4；进一步为1：1；优选的，步骤(2)中所述的4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐的摩尔比为1：1～5；进一步为1：1；优选的，步骤(3)中所述的含有四嗪官能团的红色固体、二乙基三胺五乙酸、六水氯化铽的摩尔比为1：1～2：1～2；进一步为1：1：1；优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的搅拌的时间均为6～48小时；进一步为12小时。上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针在细胞膜成像中的应用。优选的，所述的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针在肿瘤细胞的细胞膜成像或斑马鱼成像中的应用。进一步优选的，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术提供的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，具体为式Ⅰ所示的结构式，可用于肿瘤细胞的细胞膜成像。此稀土探针内含有四嗪基团，与Tb3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，其特征在于：其结构式如式Ⅰ所示：/n

【技术特征摘要】
1.生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，其特征在于：其结构式如式Ⅰ所示：



其中，式Ⅰ中X为一类连接基团，包括酰胺键、酯基，且连接基团之间的间距需小于等于10nm。


2.根据权利要求1所述的稀土探针，其特征在于：
X＝X1或X2；


3.权利要求2所述的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)IX1中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺在N,N-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂并用硅胶色谱分离得含有四嗪官能团的红色固体；
(2)IX2中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺反应的产物和4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐反应的产物在N,N-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂，硅胶色谱分离得到含有四嗪官能团的红色固体；
(3)IX1或IX2制备：将步骤(1)或(2)得到的含有四嗪官能团的红色固体与二乙基三胺五乙酸在二甲基亚砜中搅拌，用乙醚沉淀干燥，再在体积比1：1的二甲基亚砜/水中与六水氯化铽搅拌反应，乙醚沉淀干燥得稀土探针IX1或稀土探针IX2，即生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)、(2)中所述的对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺；
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸的摩尔比为5～10：5～10：1；
步骤(1)、(2)、(3)中所述的搅拌的时间均为6～48小时。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、7-氨基-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，邢达，郑举敦，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44