用于经由模板转换机制的核酸文库制备的系统和方法技术方案

本公开内容提供了包含双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列的组合物，所述双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，其中所述第二衔接子序列包含模板转换寡核苷酸（TSO）的杂交位点。本公开内容提供了使用模板转换机制制备本公开内容的组合物的方法，以将非模板碱基对添加到DNA分子的末端、使TSO与非模板碱基对杂交并然后延伸与TSO互补的序列以添加衔接子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于经由模板转换机制的核酸文库制备的系统和方法相关申请本申请要求2017年12月06日提交的临时申请USSN62/595,393的利益，其内容整体引入本文作为参考。公开内容的领域本公开内容涉及分子生物学和DNA测序领域。序列表的并入于2018年12月6日创建且大小为53KB的名称为“RMSI-012/001WOSeqListing_ST25.txt”的文本文件的内容特此整体引入作为参考。背景从少量的原材料难以有效地检测新的DNA融合事件。所述领域中的当前规程一般要求耗时的连接步骤，所述步骤需要大量的DNA。本公开内容提供了通过经由模板转换机制向DNA序列的末端添加衔接子来有效检测新融合事件的组合物和方法。概述本公开内容提供了包含双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列的组合物，所述双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列包含（a）有义链，其从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，和（b）反义链，其包含序列，所述序列包含与所述有义链（a）的序列互补的序列，其中所述第二衔接子序列包含模板转换寡核苷酸（TSO）的杂交位点。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，（b）的反义链从5'至3'包含序列，所述序列包含有义链（a）的序列的反向互补体（complement）。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，第一衔接子序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。在一些实施方案中，第一衔接子序列包含三个核苷酸。在一些实施方案中，第一衔接子序列包含聚鸟苷酸序列。在一些实施方案中，第一衔接子序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，第二衔接子序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。在一些实施方案中，第二衔接子序列包含三个核苷酸。在一些实施方案中，第二衔接子序列包含聚胞苷酸序列。在一些实施方案中，第二衔接子序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，第一衔接子序列和第二衔接子序列不相同。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，TSO的杂交位点包含聚胞苷酸序列。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，TSO的杂交位点包含聚胞苷酸序列或聚鸟苷酸序列。在一些实施方案中，TSO的杂交位点由聚胞苷酸序列组成。在一些实施方案中，TSO的杂交位点由聚胞苷酸序列或聚鸟苷酸序列组成。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，模板序列包括片段化的DNA序列。在一些实施方案中，片段化的DNA序列包括PCR产物、剪切的DNA或修复的DNA。在一些实施方案中，PCR产物是平端化的产物或具有平端的产物。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，模板序列包括片段化的DNA序列。在一些实施方案中，片段化的DNA序列包括PCR产物、剪切的DNA或修复的DNA。在一些实施方案中，剪切的DNA包括机械或酶促剪切的DNA。在一些实施方案中，剪切的DNA包括基因组DNA。在一些实施方案中，剪切的DNA包括载体。在一些实施方案中，剪切的DNA包括天然剪切的DNA。在一些实施方案中，天然剪切的DNA包括无细胞DNA（cfDNA）。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，模板序列包括片段化的DNA序列。在一些实施方案中，片段化的DNA序列包括PCR产物、剪切的DNA或修复的DNA。在一些实施方案中，修复的DNA已被酶促修复为双链的。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，TSO包含单链脱氧核糖核酸（ssDNA）序列。在一些实施方案中，TSO进一步包含二级结构。在一些实施方案中，二级结构包含发夹。在一些实施方案中，ssDNA序列包含TSO的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或其间任何百分比。在一些实施方案中，ssDNA序列包含TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。在一些实施方案中，TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸是连续的。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，TSO包含与第二衔接子的杂交位点具有至少50％互补性的杂交位点。在一些实施方案中，杂交位点与第二衔接子的杂交位点具有100％的互补性。在一些实施方案中，杂交位点包含单链核酸序列。在一些实施方案中，单链核酸序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。在一些实施方案中，单链核酸序列包含三个核苷酸。在一些实施方案中，单链核酸序列是DNA序列。在一些实施方案中，DNA序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。在一些实施方案中，单链核酸序列是RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列包含聚鸟苷酸序列。在一些实施方案中，RNA序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，TSO包含单链脱氧核糖核酸（ssDNA）序列。在一些实施方案中，ssDNA包含与引物、衔接子或阵列组分的序列具有至少50%同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，ssDNA包含与引物、衔接子或阵列组分的序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、至少100%或其间任何百分比同一性或互补性的序列。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含TSO的序列。在一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含与TSO的序列相同的序列或与TSO的序列互补的序列。在一些实施方案中，第一衔接子序列包含与第一TSO的序列相同的序列或与第一TSO的序列互补的序列，且第二衔接子序列包含与第二TSO的序列相同的序列或与第二TSO的序列互补的序列，其中所述第一TSO和所述第二TSO不相同。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含TSO的序列。在一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含与TSO的序列相同的序列或与TSO的序列互补的序列。在一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含TSO的序列的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或其间任何百分比。在一些实施方案中，第一衔接子序列或第二衔接子序列包含TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含：/n双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列，所述双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列包含：/n（a）有义链，其从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，和/n（b）反义链，其包含序列，所述序列包含与所述有义链（a）的序列互补的序列，/n其中所述第二衔接子序列包含模板转换寡核苷酸（TSO）的杂交位点。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171206 US 62/5953931.组合物，其包含：
双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列，所述双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列包含：
（a）有义链，其从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，和
（b）反义链，其包含序列，所述序列包含与所述有义链（a）的序列互补的序列，
其中所述第二衔接子序列包含模板转换寡核苷酸（TSO）的杂交位点。


2.权利要求1的组合物，其中（b）的反义链从5'至3'包含序列，所述序列包含有义链（a）的序列的反向互补体。


3.权利要求1和2的组合物，其中所述第一衔接子序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。


4.权利要求3的组合物，其中所述第一衔接子序列包含三个核苷酸。


5.权利要求3和4的组合物，其中所述第一衔接子序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述第二衔接子序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。


7.权利要求6的组合物，其中所述第二衔接子序列包含三个核苷酸。


8.权利要求6和7的组合物，其中所述第二衔接子序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述第一衔接子序列和所述第二衔接子序列不相同。


10.权利要求8的组合物，其中所述TSO的杂交位点包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


11.权利要求8的组合物，其中所述TSO的杂交位点由聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列组成。


12.权利要求1-11任一项的组合物，其中所述模板序列包括片段化的DNA序列。


13.权利要求12的组合物，其中所述片段化的DNA序列包括PCR产物、剪切的DNA或修复的DNA。


14.权利要求13的组合物，其中所述PCR产物是平端化的产物或具有平端的产物。


15.权利要求13的组合物，其中所述剪切的DNA包括机械或酶促剪切的DNA。


16.权利要求13或15的组合物，其中所述剪切的DNA包括基因组DNA。


17.权利要求13或15的组合物，其中所述剪切的DNA包括载体。


18.权利要求13的组合物，其中所述剪切的DNA包括天然剪切的DNA。


19.权利要求18的组合物，其中所述天然剪切的DNA包括无细胞DNA（cfDNA）。


20.权利要求13的组合物，其中所述修复的DNA已被酶促修复为双链的。


21.权利要求1-20任一项的组合物，其中所述TSO包含单链脱氧核糖核酸（ssDNA）序列。


22.权利要求21的组合物，其中所述TSO进一步包含二级结构。


23.权利要求22的组合物，其中所述二级结构包含发夹。


24.权利要求21-23任一项的组合物，其中所述ssDNA序列包含TSO的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或其间任何百分比。


25.权利要求21-24任一项的组合物，其中所述ssDNA序列包含TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。


26.权利要求25的组合物，其中所述TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸是连续的。


27.权利要求21-26任一项的组合物，其中所述TSO包含与所述第二衔接子的杂交位点具有至少50％互补性的杂交位点。


28.权利要求27的组合物，其中所述杂交位点与所述第二衔接子的杂交位点具有100％的互补性。


29.权利要求27或28的组合物，其中所述杂交位点包含单链核酸序列。


30.权利要求29的组合物，其中所述单链核酸序列包含1至5个核苷酸，连端点在内。


31.权利要求29的组合物，其中所述单链核酸序列包含三个核苷酸。


32.权利要求29-31任一项的组合物，其中所述单链核酸序列是DNA序列。


33.权利要求32的组合物，其中所述DNA序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


34.权利要求29-31任一项的组合物，其中所述单链核酸序列是RNA序列。


35.权利要求34的组合物，其中所述RNA序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


36.权利要求21-35任一项的组合物，其中所述ssDNA包含与引物、衔接子或阵列组分的序列具有至少50%同一性或互补性的序列。


37.权利要求36的组合物，其中所述ssDNA包含与引物、衔接子或阵列组分的序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、至少100%或其间任何百分比同一性或互补性的序列。


38.权利要求1-37任一项的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列包含TSO的序列。


39.权利要求38的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列包含与TSO的序列相同的序列或与TSO的序列互补的序列。


40.权利要求38或39的组合物，其中
所述第一衔接子序列包含与第一TSO的序列相同的序列或与第一TSO的序列互补的序列，且
所述第二衔接子序列包含与第二TSO的序列相同的序列或与第二TSO的序列互补的序列，且
其中所述第一TSO和所述第二TSO不相同。


41.权利要求38或39的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列包含TSO的序列的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或其间任何百分比。


42.权利要求38、39或41的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列包含TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。


43.权利要求42的组合物，其中所述TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸是连续的。


44.权利要求40的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列分别包含第一TSO或第二TSO的序列的至少1%、至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或其间任何百分比。


45.权利要求40或44的组合物，其中所述第一衔接子序列或所述第二衔接子序列分别包含第一TSO或第二TSO的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。


46.权利要求45的组合物，其中所述第一TSO或所述第二TSO各自的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸是连续的。


47.权利要求39-46任一项的组合物，
其中所述有义链从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，
其中所述第一衔接子序列包含与TSO的序列相同的序列，与独特标识符（UID）序列、样品标识符（SID）序列或独特分子标识符（UMI）序列的序列相同的序列和聚鸟苷酸序列，且
其中所述第二衔接子序列包含与TSO的序列互补的序列，与UID序列、SID序列或UMI序列互补的序列和聚胞苷酸序列。


48.权利要求39-46任一项的组合物，
其中所述有义链从5'至3'包含序列，所述序列包含第一衔接子序列、模板序列和第二衔接子序列，
其中所述第一衔接子序列包含与TSO的序列相同的序列，与独特标识符（UID）序列、样品标识符（SID）序列或独特分子标识符（UMI）序列的序列相同的序列和聚胞苷酸序列，且
其中所述第二衔接子序列包含与TSO的序列互补的序列，与UID序列、SID序列或UMI序列互补的序列和聚鸟苷酸序列。


49.权利要求1-49任一项的组合物，其中所述TSO包含UID序列、SID序列或UMI序列中的一种或多种。


50.权利要求49的组合物，其中所述UID序列、SID序列或UMI序列包含随机序列。


51.权利要求49的组合物，其中所述UID序列、SID序列或UMI序列包含预定序列。


52.权利要求50或51的组合物，其中所述UID序列、SID序列或UMI序列包含1至20个核苷酸的序列，连端点在内。


53.权利要求50或51的组合物，其中所述UID序列、SID序列或UMI序列包含2至12个核苷酸的序列，连端点在内。


54.权利要求50或51的组合物，其中所述UID序列、SID序列或UMI序列包含4至10个核苷酸的序列，连端点在内。


55.权利要求50或51的组合物，其中所述UID序列或SID序列包含八个核苷酸。


56.权利要求50或51的组合物，其中所述UMI序列包含七个核苷酸或由七个核苷酸组成。


57.权利要求50或51的组合物，其中所述UMI序列包含五个核苷酸或由五个核苷酸组成。


58.制备权利要求1-57任一项的组合物的方法，所述方法包括：
（a）在足以供末端转移酶活性之用的条件下使模板序列和聚合酶接触，以产生中间双链脱氧核糖核酸（dsDNA）序列，其中所述中间dsDNA在有义链和反义链的3'端包含衔接子序列；
（b）在足以供依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件下使所述中间dsDNA、聚合酶和至少一种模板转换寡核苷酸（TSO）接触，以产生权利要求1-57任一项的dsDNA。


59.权利要求58的方法，其中所述在有义链和反义链的3'端的衔接子序列包含聚鸟苷酸序列或聚胞苷酸序列。


60.权利要求58的方法，其中所述在有义链和反义链的3'端的衔接子序列包含聚鸟苷酸序列。


61.权利要求58-60任一项的方法，其中所述足以供末端转移酶活性或依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件包含许多脱氧核苷酸（dNTPs）。


62.权利要求58-61任一项的方法，其中所述足以供末端转移酶活性之用的条件包含许多dCTPs、许多dGTPs或其组合。


63.权利要求58-61任一项的方法，其中所述足以供末端转移酶活性之用的条件包含dCTPs和dGTPs的组合。


64.权利要求58-63任一项的方法，其中所述足以供依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件包含于连端点在内的27℃至50℃的温度温育2-20分钟的时间段。


65.权利要求64的方法，其中所述足以供依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件包含于42℃温育10分钟。


66.权利要求64的方法，其中所述足以供依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件包含于42℃温育5分钟。


67.权利要求58-66任一项的方法，其中所述聚合酶包括逆转录酶。


68.权利要求67的方法，其中所述逆转录酶是莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）逆转录酶。


69.权利要求68的方法，其中所述足以供依赖于DNA的DNA聚合酶活性之用的条件包含辅因子Mg2+。


70.权利要求69的方法，其中所述辅因子Mg2+以20至40mM的浓度存在。


71.权利要求69的方法，其中所述辅因子Mg2+以24至36mM的浓度存在。


72.权利要求58-71任一项的方法，其中（a）中模板DNA的浓度在0.1ng与100ng之间，连端点在内。


73.权利要求58-71任一项的方法，其中（a）中模板DNA的浓度等于或小于0.1ng、1ng、10ng或100ng。


74.制备DNA片段文库的方法，其包括：
使权利要求1-57任一项的组合物与第一正向引物、第一反向引物、聚合酶和许多dNTPs接触，并
在足以进行扩增的条件下扩增组合物的第一部分，
从而产生第一扩增产物。


75.权利要求74的方法，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物与组合物的有义链杂交。


76.权利要求74的方法，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物与组合物的反义链杂交。


77.权利要求74-76任一项的方法，其中所述第一正向引物与第一衔接子序列内的序列杂交。


78.权利要求74-76任一项的方法，其中所述第一正向引物与和TSO的序列相同的序列的一部分杂交。


79.权利要求74-78任一项的方法，其中所述第一反向引物与第二衔接子序列内的序列杂交。


80.权利要求74-79任一项的方法，其中所述第一反向引物与和TSO的序列相同的序列的一部分杂交。


81.权利要求74-79任一项的方法，其中所述第一反向引物与模板序列内的序列杂交。


82.权利要求74-81任一项的方法，其进一步包括：
使权利要求74的第一扩增产物、第二正向引物、第二反向引物、聚合酶和许多dNTPs接触，...

【专利技术属性】
技术研发人员：M拉尼克，P麦克尤恩，E范德瓦尔特，J谢，R瓦兹沃思，M斯特赖敦，
申请(专利权)人：卡帕生物系统公司，
类型：发明
国别省市：美国;US