本发明专利技术公开了一种农药对捕食性天敌体内消化酶活性影响的快速检测方法，即四维信息动态监测法。该方法是一个由网络／频谱／阻抗分析仪、电子计算机和金电极等组成的检测架，在农药的影响下，对捕食性天敌体内消化酶活性进行快速检测。利用本方法实时动态监测拟环纹豹蛛中肠蛋白消化酶对酪蛋白的酶促水解过程及三大类农药对酶活性的影响，结果表明这三大类农药的合适低剂量可显著地增强蛋白消化酶的活性，较高剂量地农药可显著抑制蛋白酶的活性，且水解过程稳态频移值可准确地反映酶活性与农药浓度的关系，证实该法比传统的紫外光光度分析法优势明显，可广泛用于生物酶的活性检测。同时低剂量农药对天敌的保护与利用及害虫防治上有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
专利说明蜘蛛体内消化酶活性的快速检测方法-四维信息法 本专利技术涉及利用低剂量的农药(有机磷类、有机氯类、菊酯类)增强蜘蛛等捕食天敌的控虫潜能，以及蜘蛛等捕食天敌体内消化酶活性的快速检测方法，属于生物
长期以来，大多的人只考虑到施用农药对环境污染及对天敌杀害的副作用，忽视了它存在的合理性。本专利技术人通过多年的探索，发现施用低剂量的化学农药既增强了天敌的控虫力，同时又不会导致环境和粮食的污染，因为这些低剂量的农药不会超出生态系统的“弹性限度”，通过生态系统的自身调节作用，生物体的生物转化及其生物修复作用，完全能把这些小剂量的有毒物质分解成无毒物质。其主要机理是低剂量农药增强了蜘蛛等天敌体内消化酶的活性和抑制了其体内乙酰胆碱酯酶的活性，从而增强了蜘蛛的消化能力及其神经系统的兴奋性，增加了蜘蛛等天敌控制害虫的潜能，因此低剂量农药在农田生态系统中具有较大的应用潜力。同时，在生物学领域创建了一种快速检测酶活性的新技术---四维信息检测，该技术与其它的压电技术不同，不需要把酶固定在金电极上，在液相中传感器能灵敏地对溶液的粘密度有较好的响应特性，且反应液采用合适pH值的磷酸缓冲液配制，不受反应过程中pH值变化的影响。与传统的酶活性检测方法相比，如分光光度法、化学发光法等，检测灵敏、快速，不需使用有毒试剂，且能提供反映所研究体系的一些物理或化学性质变化的四维动态信息。本专利技术目的是维持农田生态系统平衡，生产无公害绿色食品，配制各类农药的最适低剂量洒于稻田，充分挖掘和发挥蜘蛛等天敌的控虫潜能。同时提供一种灵敏度高，操作简便，不需把酶固定在金电极上，能现场提供反映所研究体系的一些物理或化学性质变化的四维动态信息，能全面、实时的对变化过程进行在线监测和分析体内消化酶活性的快速检测方法。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术人在主持国家自然科学基金项目研究期间，发现低剂量的化学农药能大大地增强蜘蛛等捕食性天敌的控虫效能，并试图构建一种蜘蛛等捕食性天敌体内酶活性的快速检测方法，经较长时间的研究认为，四维动态监测法是一种能实现专利技术目的的快速检测法。具体步骤是1、最适低剂量农药的选择所谓低剂量农药是指不杀死天敌也很难杀死害虫的小剂量的化学农药。首先把各类农药(有机磷类、有机氧类、菊酯类等)配制成系列的低剂量浓度，通过在不施农药时，蜘蛛的控虫力测定试验；对害虫施药，蜘蛛不施药，蜘蛛的控虫力测定试验；对蜘蛛施药、害虫不施药时，蜘蛛的控虫力试验和对蜘蛛和害虫同时施药时，蜘蛛的控虫力测定试验。筛选出增强蜘蛛控虫力的最适低剂量浓度。现已筛选出增强狼蛛类的控虫力的最适的甲胺磷(50％)、杀虫双(18％)和烯丙菊酯(0.03％)的最适低剂量浓度分别为原药∶水等于2∶5000、12∶5000和1∶20。2、酶液提取在体视显微镜下于冰浴中解剖已经用低剂量农药和高剂量农药处理的蜘蛛，取其中肠，用一定体积pH8.0的磷酸缓冲液在冰浴中研磨匀浆，匀浆液在0～4℃下用4000×g离心15min，取上清液测定消化酶的活力。也可解剖未经农药处理的蜘蛛，按上述方法得到离体的酶液，然后在酶的活性检测时，加一定量的最适低剂量浓度的农药，检测农药对酶活力的影响。3、酶液的总蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G250法测定，牛血清白蛋白为标准蛋白。4、酶液的活性检测设备和材料的准备本检测方法所需设备是一台网络/频谱/阻抗分析仪(型号HP4395)和一台与之相连的电子计算机、一个玻璃池及一面镀金一面镀银的压电石英晶体，该晶体镀金的一面作为金电极没入反应液，接入阻抗测试架的地端作为工作电极，另一面露于空气中的银电极接入阻抗分析架的非地端。玻璃池内设有一个搅拌子，玻璃池外设有控温器，把玻璃池放入控温器中，然后将两者放在磁振动器上振动。因为网络/频谱/阻抗分析仪可同步测量压电石英晶体(PQC)谐振的电导(G)与电纳(B)谱，通过HP82341C高性能HP-IB接口卡用专用程序控制阻抗分析仪获得导纳数据，运用Gauss-Newtin非线性最小二乘法实时拟合每组G与B数据并完成导纳数据和其他等效电路参数分析。采用AT——切MHZ的单面触液压电石英晶体，单面触液型镀金一面的金电极没入反应液，银电极露于空气中。用常规的合适体积的玻璃检测池，电磁搅拌器恒速搅拌。温控装置为恒温水套与超级恒温槽以及WM2K-1型温度自动控制仪，检测过程中温度均控制在27.5～28.5℃。5、消化酶的四维动态监测分析1mol/L PH7.5的PBS缓冲液2.5ml和0.2ml 0.5％的专一性底物(如酪蛋白、淀粉、橄榄油等)注入检测池中，一段时间后得到稳定的信号值，分别记为初始谐振频率(f01)、动态电阻(R11)、动态电感(L11)和静态电容(C01)作为参比值。接着，同时注入0.2ml的酶液到检测池引发反应，记录时间(t)并同步采集各电路参数信号值(即f0、R1、L1、C0)，得到整个过程的相应信号变化(即Δf0＝f0-f01)、ΔR1＝R1-R11、ΔL1＝L1-L11、ΔC0＝C0-C01)随时间的关系曲线。反应完毕后，这些参数又会维持一个相对稳定的状态，此时被记为f02、R12、L12，则相应的终点变化值分别为Δfm(＝f02-f01)、ΔRM(＝R12-R11)、ΔLm(＝L12-L11)和ΔCm(＝C02-C01)。通过其中的频率变化就可实现对消化酶水解底物过程的实时监测，即由Δf-t曲线即可得到酶促反应的初速度V(Δf/t)。6、将测定的参数信息动态送入计算机，在专用程序控制下，经运算并打印出相应的曲线图，供研究人员分析。本专利技术的有益效果是①本专利技术采用该方法动态监测生物体内消化酶对底物的酶促水解过程及有毒物质(如农药、有机磷类、有机氯类和菊酯类)对酶活性的影响，与传统的紫外分光光度分析法相比，灵敏度高，优势明显，在计算机的参与下，能反映所研究体系的一些物理和化学性质的多维动态信息，能全面、实时的对变化过程进行在线监测和分析。用本专利技术所述方法检测三大农药对生物体内消化酶的活性影响，准确、迅速的得出如下结论，即上述三大农药的合适低剂量可显著地增强消化酶的活性，较高剂量的农药可显著抑制消化酶的活性，这为人们正确使用农药，利用天敌控制害虫，充分发挥天敌的控虫效能，降低农作物的生产成本，减少农产品的农药残留量都有积极作用。②本专利技术方法所用设备少，操作简便、快捷、检测成本低，因此便于推广应用。③最适低剂量农药可广泛应用于农业生产中，对保护和利用天敌，充分发挥天敌控虫潜能，生产无公害食品，减少其副作用及协调生防和化防的关系，都具有积极的意义。下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。附图说明图1是本专利技术所用仪器装置的结构示意图。图2是没有农药时四个压电参数对时间的关系图。图3是不同甲胺磷农药浓度下的频率变化时间曲线。其中农药浓度分别为1为2∶5000，2为0，3为4∶5000，4为5∶5000，5为8∶5000。图4是不同有机氯农药(杀虫双)浓度下的频率响应对时间的曲线。图5是不同菊酯类(烯丙菊酯)浓度下的频率响应对时间的曲线。实施例用该方法动态监测拟环纹豹蛛中肠蛋白消化酶对酪蛋白的酶促水解过程及三大类农药对酶活性的影响，具体步骤如下①试验设备和条件的准备，参照附图1选择一台HP4395A网络/频谱/阻抗分析本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农药对蜘蛛体内消化酶活性影响的快速检测方法。其特征是该检测方法包括如下步骤：①最适低剂量农药的选择首先把各类农药（有机磷类、有机氧类、菊酯类等）配制成系列的低剂量浓度，通过在不施农药时，蜘蛛的控虫力测定试验；对害虫施药， 蜘蛛不施药，蜘蛛的控虫力测定试验；对蜘蛛施药、害虫不施药时，蜘蛛的控虫力试验和对蜘蛛和害虫同时施药时，蜘蛛的控虫力测定试验，筛选出增强蜘蛛控虫力的最适低剂量浓度，现已筛选出增强狼蛛类的控虫力的最适的甲胺磷（５０％）、杀虫双（１８％）和烯丙菊酯（０．０３％）的最适低剂量浓度分别为原药：水等于２∶５０００、１２∶５０００和１∶２０；②酶液提取在体视显微镜下于冰浴中解剖已经用低剂量农药和高剂量农药处理的蜘蛛，取其中肠和消化腺，用一定体积ＰＨ８．０的磷酸缓冲液在冰浴中 研磨匀浆，匀浆液在０～４℃下用４０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，取上清液测定消化酶的活力，也可解剖未经农药处理的蜘蛛，按上述方法得到离体的酶液，然后在酶的活力检测时，加一定量的最适低剂量浓度的农药，检测农药对酶活力的影响；③酶液的总蛋白含 量测定：采用考马斯亮蓝Ｇ２５０法测定，牛血清白蛋白为标准蛋白；④酶液的活性检测设备和材料的准备：本检测方法所需设备是：一台网络／频谱／阻抗分析仪（型号ＨＰ４３９５）和一台与之相连的电子计算在阻抗分析仪的输入端通过管道连至一个 玻璃池内，玻璃池内设有反应液，反应液中设有一面镀金另一面镀银的压电石英晶体，玻璃池内的底部设有一个搅拌子，玻璃池外设有温控器，玻璃池外的底部设有磁性搅拌器，把玻璃池放入温控器中，然后将两者放在磁搅拌器上振动；⑤消化酶活性的四维动态检 测１ｍｏｌ／ＬＰＨ７．５的ＰＢＳ缓冲液２．５ｍｌ和０．２ｍｌ０．５％的专一性底物，如酪蛋白、淀粉、橄榄油等注入检测池中，一段时间后得到稳定的信号值，分别记为初始谐振频率（ｆ↓［０１］）、动态电阻（Ｒ↓［１１］）、动态电感（Ｌ ↓［１１］）和静态电容（Ｃ↓［０１］）作为参比值，接着，同时注入０．２ｍｌ的酶液到检测池引发反应，记录时间（ｔ）并同步采集各电路参数信号值（即ｆ↓［０］、Ｒ↓［１］、Ｌ↓［１］、Ｃ↓［０］），得到整个过程的相应信号变化（即△ｆ↓［０］＝ｆ↓［０］－ｆ↓［０１］）、△Ｒ↓［１］＝Ｒ↓［１］－Ｒ↓［１１］、△Ｌ↓［１］＝Ｌ↓［１］－Ｌ↓［１１］、△Ｃ↓［０］＝Ｃ↓［０...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王智，
申请(专利权)人：王智，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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