一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法技术

本发明专利技术提供一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，该尿液蛋白质指纹图谱 由4个质荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白质或多 肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成，采用人工神经 网络(Artificial neural networks，ANN)前馈式反向传算法的方法进行质 谱数据的分析。本发明专利技术通过检测尿液蛋白质指纹图谱，提供一种新的非侵入性 的检测方法，从而为糖尿病肾病早期发现、为进一步寻找早期糖尿病肾病的特 异性生物标记、为糖尿病肾病的病机探索和开发新的治疗方法提供思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于指纹图谱的检测方法，涉及，为一种新的非侵入性的检测方法，用于糖尿病早期肾病的辅助诊断。
技术介绍
糖尿病(DM)是继心血管、肿瘤之后第三位严重危害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化、生活方式的改变而迅速增加。截止2003年，全世界糖尿病患者已达1.35亿，其中中国有2380万，预计到2025年DM总人数达到3亿。DM的最大危害在其脏器并发症，其中糖尿病肾病是DM最常见、最重要的并发症，也是DM患者死亡的主要原因之一。临床上大约30％～50％的1型DM患者和20％的2型DM患者伴有明显的肾脏损害，其中约1/3进一步发展为晚期糖尿病肾病和终末期肾功能衰竭(ESRD)。在发达国家和国内一些发达地区，糖尿病肾病是ESRD血液透析病人的首位病因。其确切发病机制至今未明，高糖毒性、肾脏血流动力学改变、脂代谢紊乱、高血压影响以及吸烟、低出生体重、身材矮小、遗传、种族、性别、环境等均是糖尿病肾病的危险因素，同时又具有遗传上的多态性。所以寻找对糖尿病肾病高度特异的生物标记物，用于筛选与其发生发展相关的基因，早期诊断和预防糖尿病肾病，成为目前研究的重要方向。新近出现的蛋白芯片技术是一种全新的蛋白质组学研究手段，该方法克服了传统蛋白质组学研究方法存在的诸多问题，实现了质谱技术用于临床检测的飞跃，为从蛋白分子水平探索研究糖尿病肾病展现又一崭新前景。一般认为10年以上病程的糖尿病发生肾脏损害的机会很大。但是新近有研究提出糖尿病肾病与个体的易感基因密切相关，有可能终身不发生，也可能一起病就累及肾脏。目前对其易感基因的研究涉及糖脂代谢相关(如醛糖还原酶基因、葡萄糖转运蛋白-1基因、载脂蛋白基因)、血流动力学相关(如内皮素-1基因、肾素血管紧张素基因、一氧化氮合酶基因)以及胰岛素敏感性、细胞外基质代谢、信号传导相关基因等方面，但均是特异性不高。而针对这些机制的一些特殊治疗，如内皮素抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、TGF-β中和抗体等等，在人体均未能得到证实。因而，对DN患者尚缺乏有效的治疗手段，即出现临床蛋白尿后，大部分患者将不可避免地进入终末期肾功能衰竭。然而早期肾病的发展是可以被阻止或延缓的，更早期病变甚至是可以逆转的，关键是做到早期诊断。临床上糖尿病肾病分为五期，其中微量白蛋白尿是当前国内、外公认的早期诊断DN指标。微量白蛋白尿是指24h尿白蛋白定量30-300mg(mogensen糖尿病肾病分期法)或随机尿白蛋白与肌酐比值30-300mg/g.cr。但此时也已是DN III期，而且微量白蛋白尿可能受到其它多种因素，如尿路感染、月经期、剧烈运动、高血压、心脏病及其他肾病等因素影响。事实上，在出现微量白蛋白尿之前(即I、II高肾小球滤过期)，肾脏已出现病理改变，包括肾小球基膜增厚，细胞外基质增生，与此相应也出现了尿蛋白异常，这些多为一些低浓度的小分子蛋白，用传统的检测方法(如免疫法、金标定量渗滤法、磺基水杨酸法、溴酚兰法)很难检测到。因此探索和建立一种简便的，同时灵敏度和特异性均较高的糖尿病最早期肾病生物标记物十分必要。SELDI-TOF-MS技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法。以这一技术为基础开发的系列蛋白质芯片可以非特异性的结合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受激光轰击时，各种结合的蛋白质会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比的离子在电场中飞行的时间长短不一，因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡直观地用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成相应图谱，用于分析、判别。这一方法具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点，可检测到fmol(10-15mol)数量级的微量蛋白质，并且样本不需进行精细的分离，粗样本就可直接点样。对照分析患者和正常人的质谱图，可发现和捕获新的特异性疾病相关蛋白及其特征。然而，通过这一方法获得的数据是海量的，必需要运用生物信息学手段来分析处理。人工神经网络(ANNs)和支持向量机(SVMs)是近年来开发和应用最广泛的生物信息学算法，也已成熟用于蛋白芯片的研究。目前，用SELDI蛋白芯片技术获得有意义成果的数量已经日益凸现，在筛选肿瘤标记物、多囊卵巢综合征和系统性红斑狼疮的研究中都有多项报道，有的已应用临床，但在糖尿病的研究中只有很少报道。本研究采用SELDI-TOF-MS芯片技术，进行糖尿病患者的尿液蛋白质质谱检测，以往多数糖尿病蛋白芯片研究都着眼于患者的血清及相关组织，对于尿液蛋白质质谱的研究甚少。尿蛋白的60％来自血浆蛋白，40％来自肾脏及其它泌尿生殖组织，因此不仅能反映肾脏的病变，还能体现机体的代谢异常。有学者用毛细血管电泳(CE)联合质谱技术发现1型糖尿病的尿液中有1000余种蛋白，分子量为800D-66.5KD。而在2型糖尿病亲属的尿液中发现分子量100KD的蛋白，与胰岛素抵抗有关。尿液样本获取方便，芯片高通量、大样本的特点也适宜疾病筛查，在临床上有很大的潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，通过以下步骤实现(1)尿白蛋白准备根据测定的尿白蛋白分为四组，A组健康对照组，B组尿白蛋白＜30mg/g.cr，C组30≤尿白蛋白≤300mg/g.cr，D组尿白蛋白＞300mg/g.cr，分装冻存于-80℃低温冰箱中；(2)数据收集和处理采用PBS-II型表面增强激光解析-电离时间飞行质谱仪(SELDI-TOF-MS)进行质谱数据收集，其中激光强度150，检测敏感度6，收集数据的质荷比范围为1000～100000，收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次，采用H4(疏水性)蛋白质芯片、去离子水，基质SPA(sinapinic acid，芥子酸)；(3)对获得的质谱数据进行检测采用人工神经网络(Artificial neuralnetworks，ANN)前馈式反向传算法的方法进行质谱数据的分析，该蛋白质指纹图谱由4个质荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白质或多肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。对尿白蛋白质荷比峰值进行ROC(Receiver operating characteristic接受者工作特征)分析。本专利技术应用SELDI-TOF-MS，对糖尿病患者和正常对照组的尿液蛋白质做筛选，在捕获到的1000余种蛋白质中大部分没有差异，利用Biomarker Wizard初步聚类，产生200个左右有差异的质荷比峰值。提示SELDI-TOF-MS芯片可有效避免血液中正常滤过的和肾脏及其它泌尿组织正常分泌的蛋白的干扰，捕获到尿液中的微量蛋白，通过蛋白质芯片的检测可以从糖尿病患者的尿液中找到与疾病相关的微量差异性蛋白。进一步分析发现，(1)糖尿病患者无蛋白尿和微量白蛋白尿组(B和C组)比较筛选出18种差异蛋白中有14种的M/Z＜10000，通过P值评价每个峰，有5种蛋白比Alb(白蛋白)的差异更有显著性，说明在糖尿病肾病早期尿液中存在的蛋白以小分子蛋白为主，而且尚存在比Alb更有特异性甚至更早出现的蛋白。目前传统的检测方法能检出的尿蛋白如Alb(分子量69KD)、转铁蛋白(77KD)、a1-微球蛋白(26KD)、B2-微球蛋白(11.8KD)、N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，其特征是通过以下步骤实现：（１）尿白蛋白准备：根据测定的尿白蛋白分为四组，Ａ组：健康对照组，Ｂ组：尿白蛋白＜３０ｍｇ／ｇ．ｃｒ，Ｃ组：３０≤尿白蛋白≤３００ｍｇ／ｇ．ｃｒ，Ｄ组：尿白蛋白＞３００ｍｇ／ｇ．ｃｒ，分装冻存于－８０℃低温冰箱中；（２）数据收集和处理：采用ＰＢＳ－Ⅱ型表面增强激光解析－电离时间飞行质谱仪进行质谱数据收集，其中激光强度１５０，检测敏感度６，收集数据的质荷比范围为１０００～１０００００，收集位置２０～８０，平均每点收集２０次，收集总点数为１４０次，并采用Ｈ４蛋白质芯片、去离子水、芥子酸基质；（３）对获得的质谱数据进行检测：是依据由４个质荷比位于５２８１．１、４１３９．０、５８９８．５和４４５３．５的蛋白质或多肽组成的质谱模型，并利用人工神经网络分析获得检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈益定，谷卫，邹丽霞，单鹏飞，何晓雯，
申请(专利权)人：陈益定，谷卫，邹丽霞，单鹏飞，何晓雯，
类型：发明
国别省市：86