新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法技术

本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法；本申请芯片中的环介导等温扩增引物基于新型冠状病毒的ORF1ab基因部分区域设计；微孔芯片使用激光刻蚀技术制备；本申请的芯片能够对新型冠状病毒进行恒温、快速、高通量检测，检测结果可直接肉眼读取。

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法
本申请属于分子生物学检测和传染病检测控制领域，具体地，本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片及制备和使用方法。
技术介绍
在曾被寄予厚望的瑞德西韦、氯喹、莲花清瘟胶囊等药物临床效果并不理想，疫苗研发尚需很长周期的情况下，新冠病毒感染的控制主要依赖于严格的物理隔离切断病毒传播途径，使用隔离方法控制疾病时，及时、准确的诊断疾病/甄别感染者是快速控制疾病，并减少经济损失和社会影响的关键。虽然有一些免疫检测方法得到报道和应用，但目前，新型冠状病毒的检测仍然主要依赖于分子生物学检测方法。我国现有报道的已研发或上市的分子诊断即时检测(POCT)设备，主要是基于实时荧光PCR技术，其在临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要的作用，然而由于耗时长、对检测仪器要求高(需要沉重且昂贵且需电力支持的PCR仪器)，需要集中送检等限制，不利于开展大规模的筛查，并不能完全满足当前即时快速的检测需求；另一方面，由于传统核酸检测手段操作相对繁琐，容易出现操作疏漏，而且新冠病毒的常见检测样本—咽拭子中病毒含量经常较低，传统核酸检测手段容易出现遗漏感染者的假阴性问题(HuanqinHanetal.，SARS-CoV-2RNAMoreReadilyDetectedinInducedSputumThaninThroatSwabsofConvalescentCOVID-19Patients，LancetInfectDis.2020)。综上，研究灵敏度、特异性更好，耗时短，操作简单地新分子生物学新冠病毒检测方法对于控制该疾病有着重要而紧迫的意义。
技术实现思路
环介导等温扩增技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。本专利技术基于环介导等温扩增技术，通过激光蚀刻方法制备了新型冠状病毒环介导等温扩增检测芯片，实现了对新型冠状病毒的低成本、高通量、即时快速检测；其中的引物基于新冠病毒的ORF1ab基因区域设计，具有良好的灵敏度和特异性。一方面，本申请提供了检测新型冠状病毒的环介导等温扩增检测芯片，其特征在于，其中包含检测新型冠状病毒的环介导等温扩增引物，所述引物针对新型冠状病毒的ORF1ab基因设计。进一步地，其中引物针对SEQIDNO.1设计。进一步地，其中引物序列为：1-F3：SEQIDNO.2；1-B3：SEQIDNO.3；1-FIP：SEQIDNO.41-BIP：SEQIDNO.51-LoopF：SEQIDNO.61-LoopR：SEQIDNO.7。进一步地，其中还包含反应缓冲液和荧光染料。进一步地，其基板材料为聚甲基丙烯酸甲酯基；所述芯片上设置有10X10排布的100个锥形孔；锥形孔上下直径分别为2mm与5mm；所述芯片厚度为3mm。进一步地，芯片包含BRAC1对照阳性对照区域，其中包含引物：BRAC1F3：SEQIDNO.20；BRAC1B3：SEQIDNO.21；BRAC1LPF：SEQIDNO.22；BRAC1LPR：SEQIDNO.23；BRAC1FIP：SEQIDNO.24；BRAC1BIP：SEQIDNO.25。另一方面，本申请提供了上述芯片在检测新型冠状病毒中的用途，所述用途为非诊断目的。进一步地，其检测对象为咽拭子样本。另一方面，本申请提供了检测新型冠状病毒的生物芯片，其上设置有10X10排布的100个锥形孔，锥形孔包含样本检测区域和阳性和阴性对照区域，样本检测区域中设置有检测新型冠状病毒的试剂。进一步地，其中检测新型冠状病毒的试剂为引物和/或探针。进一步地，其中阳性对照区域中包含检测BRAC1的试剂。进一步地，其中锥形孔上下直径分别为2mm与5mm，芯片厚度为3mm。本申请所检测的病毒种类包括但不限于已知的新型冠状病毒毒株，经过相应调整后本申请也适用于申请日之后发现的新型冠状病毒新毒株和变体。本申请所适用的样本包括但不限于咽拭子、痰液、口腔/鼻腔拭子、血液、其他体液样本、组织样本、环境样本等，本领域技术人员已知这些样本的常规处理方法。本申请中的非诊断用途包括但不限于环境卫生检测、疾病整体防控/流行趋势检测、食品、日用品检测。ORF1ab基因序列可以在诸如Genbank、EMBL等网站检索到、从论文中获取、或者基于实际检测的样本测序获得，不局限于已知的ORF1ab基因序列，新毒株和变体的不同ORF1ab基因序列经过验证也可以使用。本申请中的环介导等温扩增引物可以基于ORF1ab序列使用现有环介导等温扩增引物设计工具/网站设计，这些工具/网站包括但不限于PrimerExplorer、BiosunLAMP、Premierbiosoft、LAMPdesigner等，也可以由相关公司提供设计。本申请中的反应缓冲液中可使用已知/研究中的环介导等温扩增反应用成分，这些成分包含但不限于Bst聚合酶、dNTPs、MgSO4、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH4)2SO4等。本申请的荧光染料可以使用各种已知/研究中的荧光染料，包括但不限于Calcein/钙黄绿素、SYBRGreen、EvaGreen、HNB等；目视检测外，可以根据需要使用各种荧光检测仪、浊度仪检测颜色的变化。本申请的反应参数可以参照现有技术、样本类型、检测要求常规确定。本申请中的芯片可以使用激光蚀刻、化学蚀刻、机械加工、丝网印刷等方法在各种有机无机材料上加工制备，材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃、金属等；孔洞大小可以为锥形、圆柱形等，孔洞直径可以根据反应体系体积常规调整；基板材料厚度可选但不限于1-10mm；孔径可选但不限于0.5-10mm。附图说明图1为本专利技术的环介导等温扩增引物设计示意图；图2为三组引物的在不同浓度拷贝下的扩增效果比较；图3为环介导等温扩增芯片示意图；图4为最低检测限测定结果；图5为高通量微孔阵列芯片检测性能：(A)检测灵敏度测试；(B)多参数微孔阵列芯片检测扩增所需时间与商用八连管对比结果。具体实施方式实施例1环介导等温扩增引物设计和效果验证如图1所示，针对ORF1ab基因片段(SEQIDNO.1)，分别设计了三套引物系统，如下表所示：表1.新冠病毒引物序列设计并且基于这三套引物系统，分别对ORF1ab基因的质粒高(109拷贝/mL)、中(108拷贝/mL)、低(107拷贝/mL)三个浓度的检测目标进行检测。如图2所示，当目标检测物浓度较高时，不同组引物之间的扩增速度和性能基本一致，而当目标检测物浓度较低时，第一组引物实现扩增检测的速度要明显由于第二组以及第三组引物。测试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测新型冠状病毒的环介导等温扩增检测芯片，其特征在于，其中包含检测新型冠状病毒的环介导等温扩增引物，所述引物针对新型冠状病毒的ORF1ab基因设计。/n

【技术特征摘要】
1.检测新型冠状病毒的环介导等温扩增检测芯片，其特征在于，其中包含检测新型冠状病毒的环介导等温扩增引物，所述引物针对新型冠状病毒的ORF1ab基因设计。


2.根据权利要求1的芯片，其中引物针对SEQIDNO.1设计。


3.根据权利要求1的芯片，其中引物序列为：
1-F3：SEQIDNO.2；
1-B3：SEQIDNO.3；
1-FIP：SEQIDNO.4
1-BIP：SEQIDNO.5
1-LoopF：SEQIDNO.6
1-LoopR：SEQIDNO.7。


4.根据权利要求1-3任一项的芯片，其中还包含反应缓冲液和荧光染料。


5.根据权利要求1-4任一项的芯片，其基板材料为聚甲基丙烯酸甲酯基。


6.根据权利要求1-5任一项的芯片，所述芯片上设置有10X10排布的100个锥形孔。


7.根据权利要求6的芯片，锥形孔上下直径分别为2mm与5mm。


8.根据权利要求7的芯片，所述芯片厚度为3mm。


9.根据权利要求1-8任一项的芯片，其中包含BRAC1对照阳性对照区域。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：常凌乾，王杨，耿佳，应斌武，樊瑜波，李为民，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：北京;11