本发明专利技术涉及制备非层状的与蛋白质物质连接的可生物再吸收微颗粒的方法，其特征在于它包含步骤有：（ｉ）不用稳定剂和去污剂而从至少一种可生物再吸收的聚合物制备所述微颗粒，及（ｉｉ）不用去污剂将所述蛋白质物质连接到步骤（ｉ）中得到的微颗粒。它进一步涉及由此得到的可生物再吸收微颗粒及其在诊断和治疗中的应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,由此得到的微颗粒以及其应用的制作方法， 由此得到的微颗粒以及其应用本专利技术涉及连接了蛋白质物质的新的可生物再吸收的颗粒，其尤 其在免疫接种领域有用。蛋白质物质，例如蛋白质和肽，也被称作抗原，在许多疾病例如 源于病毒的疾病的治疗中被广泛应用，通常应用的形式是疫苗制剂。为增强抗原的活性和强度及改善含有抗原的药物组合物的稳定 性，这些组合物包含佐剂。基于这种考虑，疫苗制剂经常包含增强细 胞介导性反应和体液反应的免疫佐剂。尽管有这类佐剂的存在，传统疫苗也经常具有缺陷，其提供了针 对被粑向的致病性因子的非定向性保护。术语"定向性保护"是表示 同时包括了免疫系统的细胞介导性反应和体液反应的保护。为获得合适的免疫反应，与抗原相连的颗粒载体被应用，所述抗 原或者吸附到载体上，或者包埋在载体中。这类载体拥有将出现在免 疫系统中的目的抗原的多重拷贝，而促进了抗原在局部淋巴结的俘获 与保留。颗粒能被抗原呈递细胞所吞噬，并能增加抗原呈递给免疫系 统。这类载体的实例包括聚(甲基异丁烯酸酯)聚合物，由聚丙交酯例如分别已知为D-PLA和L-PLA的聚(D-和L-乳酸)制成的微颗粒，以及 由已知为PLG的聚(丙交酯-共-乙交酯)制成的微颗粒。其中俘获了抗原的基于PLG的微颗粒适合激发免疫反应。作为实 例，Moore等(1995， Vaccine, 13: 1741-1749)已说明微嚢化的HIV病毒gpl20抗原诱导HIV专一的CD4+和CD8+ T细胞反应。类似地， Vordemeier等(1995， Vaccine, 13: 1576-1582)已说明PLG-俘获的结 核分枝杆菌(妙c063"er/咖f由,Ci//,、)抗原在以该抗原免疫的 小鼠中同时诱导体液反应和T细胞反应。虽然这些类型的佐剂相对于其它更具毒性的系统而"T^供了一些 优点，但它们也具有缺陷，即微颗粒的产生有困难，并涉及了能使抗 原变性并破坏其免疫原性的腐蚀性化学产品例如溶剂的应用。此外， 抗原也可能因俘获过程例如包嚢化中所需的剧烈搅动而降解。因此建议应用这样的微颗粒，其吸附有抗原或在它们的表面上移 植有抗原(Rock K丄，Efficient MHC I presentation of exogenous Ag， PNAS 1993)。然而某些作者，例如Eldrige等，在Infect. Immun.， 59: 2978-2986 (1991)中指出，为了实现合适的佐剂效应，抗原必须被 俘获在微颗粒中。PCT专利申请号WO97/0281Q描述了抗原能吸附到其上的由生物 可降解聚合物组成的颗粒。这些颗粒对这些抗原的传递有用。这些颗 粒的缺陷是因应用结晶的或部分结晶的聚合物而产生的层状性质，也 就是不可能控制它们的大小。实际上，将要免疫接种的颗粒必须具有 亚微米(submicronic)大小，以便在转染与免疫化中有效。作为它们的一部分内容，专利申请号WO 98/33487和WO 00/06123 描述了抗原吸附于其上的基于聚丙交酯或PLG的微颗粒，以及其有关 刺激免疫反应的应用。这些专利申请的抗原吸附于其上的所有微颗粒， 其获得都应用了表面活性剂以保持所述微颗粒的胶体稳定性，也应用 了稳定剂例如聚乙烯醇用于聚合物颗粒的制备。这样得到的微颗粒的 缺陷是因所述表面活性剂与所述稳定剂在微颗粒中的存在而引起的它 们的毒性。本申请者现在发现，不同于所有的预期，有可能得到球形的、最多微米(micronic)大小的非层状可生物再吸收的微颗粒，其连接了 被寻求来触发免疫反应的抗原性蛋白质物质，并且避免了上述缺陷， 即，由于它们的制备中没有稳定剂与表面活性剂用于聚合物微颗粒的 制备，也没有表面活性剂用于抗原与微颗粒表面的连接，那么它们就 没有毒性，也没有胶体稳定性损失。因此，本专利技术的第一个主题包括连接有蛋白质物质的可生物再吸 收的微颗粒的制备方法，特征在于它包含步骤有(i) 不用稳定剂和表面活性剂而从至少一种可生物再吸收的聚合 物制备所述微颗粒，及(ii) 不用表面活性剂而将所述蛋白质物质连接到步骤(i)中得到 的微颗粒。以本专利技术的方法得到的微颗粒避免了稳定剂和表面活性剂，因此 它们是新的。因此，本专利技术的另一个主题包括连接有蛋白质物质的可生物再吸 收的微颗粒，其通过本专利技术的方法可制得。不同于所有预期，本专利技术的颗粒保留了它们的胶体稳定性。本专利技术的微颗粒对刺激细胞介导性反应和体液反应两者有用，因 此它们在治疗和诊断中都有用。因此，本专利技术的另一个主题包括本专利技术的微颗粒用于制备含有本 专利技术的微颗粒的医学产品、药物组合物尤其是疫苗的应用。最后，本专利技术的另 一个主题包括本专利技术的微颗粒在体外诊断涉及 连接到所述微颗粒的蛋白质物质的病理性状态中的应用。将用于免疫接种的微颗粒必须对接受它们的生物体无毒，而同时 要保留它们的胶体稳定性。不同于所有预期，既不用表面活性剂也不用稳定剂的本专利技术的方 法使获得这类颗粒成为可能。术语"微颗粒"是表示最多微米大小的颗粒，优选最多亚微米大 小，以便使它们进入抗原呈递细胞。术语"最多微米大小，，是表示小于或等于99Vm的大小，而术语 "最多亚微米大小"是表示小于或等于999nm的大小。微颗粒优选具有小于或等于3nm的粒径。更优选地，本专利技术的颗 粒是亚微米大小，优选直径在150与900nm之间，更优选在250与 700nm之间。颗粒大小易于通过本领域技术人员已知的方法测定，例如应用扫 描电子显微术，准弹性光散射或透射电子显微术。术语"毒性微颗粒"是表示含有至少一种化合物的微颗粒，所述 化合物能在接受微颗粒的生物体中引起生物疾病例如代谢紊乱。本专利技术的方法的第一个步骤包括不使用稳定剂和表面活性剂从至 少一种可生物再吸收的聚合物制备所述微颗粒。术语"可生物再吸收的聚合物"是表示这样的聚合物，它能在其被引入的生物体内降解成为通过自然途径能被清除的化合物。此聚合 物可以是无定形的，轻微结晶的或结晶的。这类可生物再吸收的聚合物的实例包括但不限于，聚(a-羟基酸) 聚羟丁酸，聚己酸内酯，聚原酸酯和聚酐。本专利技术的方法中应用的可 生物再吸收的聚合物优选是聚(a-羟基酸)例如聚(D-乳酸)，聚(L-乳 酸)(称为PLA)，聚乙醇酸(称为PLG)，或者聚(a-羟基酸)的混合物例 如聚(D-和L-乳酸)的混合物，聚L-乳酸和聚乙醇酸的混合物，聚D-乳酸和聚乙醇酸的混合物，或聚(D-和L-乳酸)与聚乙醇酸的混合物， 它们组成了本专利技术的实施方案。当本专利技术的方法中应用的聚合物是聚(a-羟基酸)的混合物时，每 一组分的比例能易于被本领域技术人员所测定。因此，例如，有可能 以本领域技术人员已知的各种百分比应用聚(d-和l-乳酸)的外消旋 的混合物或PLA/PLG混合物。从至少一种可生物再吸收的聚合物制备本专利技术的微颗粒能通过本 领域技术人员已知的制备微颗粒且没有应用稳定剂与表面活性剂的任 何方法而实施。实际上，本专利技术的方法的步骤(i)特征就在于没有应用 这类试剂。微颗粒制备方法中通常应用的稳定剂包括，例如，聚乙烯醇， pluronics (聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物)，及阳离子或阴离子 表面活性剂例如十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基硫酸钠。当然，当现有技术的方法中应用的稳定剂是表面活性剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备非层状的与蛋白质物质连接的可生物再吸收微颗粒的方法，特征在于它包含步骤： （ｉ）不用稳定剂和表面活性剂而从至少一种的可生物再吸收的聚合物制备所述微颗粒，及 （ｉｉ）不用表面活性剂而将所述蛋白质物质连接到步骤（ｉ）中得到的微颗粒。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y阿塔曼奥纳尔，T德莱尔，G安绍斯普，P让南，G帕朗奥斯巴卡拉，B韦里耶，
申请(专利权)人：拜奥默里克斯公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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