一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法。包括细胞复苏、NK细胞的诱导、NK细胞扩增三个步骤；其中，在NK细胞的诱导阶段，使用CD 16、胸腺肽用PBS液稀释后进行培养瓶包被；取无血清培养液加入IL‑2、IL‑12、IL‑15配制成诱导培养基；取无血清培养液加入IL‑2、IL‑7配制成活化培养基；取无血清培养液加入IL‑2配制成扩增培养基，day3采用半换液进行补液进行活化培养。利用本发明专利技术培养方法进行冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞简单高效，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，可以有效克服冻存的PBMC诱导NK细胞困难，扩增数量的不足，达到细胞治疗的目的，使其抗肿瘤、抗病毒及抗感染能力增强。

【技术实现步骤摘要】
一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法
本专利技术属于免疫细胞治疗
，涉及一种冻存人PBMC(外周血单个核细胞)复苏后体外诱导NK细胞的培养方法。技术背景自然杀伤细胞(naturalkillercells，NK细胞)，是一群大颗粒淋巴细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线。NK细胞主要分布于外周血中，占外周淋巴细胞的5～10％，淋巴结和骨髓中也存在有NK活性，但与外周血相比较水平较低。随着对NK细胞的深入研究，NK细胞在人体的应用也越来越广泛，目前在抗肿瘤、对抗衰老、亚健康治疗、疾病预防等方面都有较好的作用。首先，NK细胞具有细胞毒性功能，它能直接杀伤肿瘤细胞。其次，NK细胞可以与衰老或者病变细胞表面的受体结合，释放出穿孔素、颗粒酶和一些细胞因子，诱导细胞凋亡信号的产生，促使衰老或者病变的细胞走向凋亡，恢复机体内微环境的平衡，减缓炎症状态。同时NK细胞还能刺激和恢复机体新生细胞的产生，改善细胞质量，提高细胞活性，以此来防止和延缓细胞的病变，并恢复细胞、器官和免疫系统的功能，从而来达到疾病预防、康复以及对抗衰老的目的。肿瘤患者在采用NK细胞治疗时，一般在手术切除后治疗或者与作为放疗化疗的辅助治疗。然而，患者在接受手术切除或者放化疗治疗之后，机体的免疫功能低下，并不利于抽血进行NK细胞体外培养，因此，对于有需要进行NK细胞治疗的患者，我们需要在手术或者放化疗前进行抽血并保存。且随着细胞储备概念的普及，较多的人选择在自己健康状态良好的时候，冻存部分PBMC，可用于今后亚健康及疾病的治疗。之所以选择冻存PBMC，首先是因为，NK细胞从血液中很难分离出来。其次，NK细胞在外周血中所占的比例非常小，如果我们直接对抽取的血液进行保存成本过高。再次，PBMC较易从血液中被分离出来，且被冻存过的PBMC仍具有高效诱导NK细胞的能力。对于细胞的保存，细胞冻存是主要方法之一，也是目前最常见的方法。利用冻存技术可以将细胞置于-196℃液氮中进行低温保存，让细胞暂时脱离生长状态但将其细胞的特性保存了起来，这样在我们需要的时候再将细胞复苏用于实验。目前细胞冻存多采用程序降温的方法，慢冻的基本原则，这样可以最大限度的保存细胞活率。复苏细胞则采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。这样冻存复苏过后的细胞，会因冻存液的配制和冻存时间的影响，虽在形态上无明显差异，但在数量上会有较大的损失，诱导成NK细胞较为困难。另外，目前外周血NK细胞的培养方法主要有因子诱导法、滋养层细胞共培养法、流式分选细胞再培养法三种；但是对于冻存复苏后的PBMC，前述三种方法诱导出来的NK细胞活率较差、诱导方法不稳定且争议较大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法；促进冻存复苏后的PBMC诱导NK细胞的效率、数量的提升和安全性。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法，包括细胞复苏、NK细胞的诱导、NK细胞扩增三个步骤；所述NK细胞诱导步骤具体包括：Day0，使用CD16、胸腺肽用PBS液稀释，进行培养瓶包被，混匀后室温静置60min，加入PBS液洗涤一次；Day0取无血清培养液加入IL-2、IL-12、IL-15配制成诱导培养基，使用诱导培养基将孵育后离心的PBMC按密度2.5～3.0×106个/ml接种到包被好的瓶中，添加10％灭活的自体血浆，静置于37℃5％CO2培养箱培养；Day3，取无血清培养液加入IL-2、IL-7配制成活化培养基；采用半换液进行补液，将细胞离心后，半换液重悬细胞接种回原瓶，并补加入等量的活化培养基；Day5和Day7补加活化培养基，使细胞密度维持1.5～2×106个/ml，Day7转到细胞培养袋扩大培养。作为一种可能方案，所述CD16有效浓度范围为500ug/cm2～1500ug/cm2；所述胸腺肽有效浓度范围为150ug/cm2～500ug/cm2。作为进一步的方案，所述CD16有效浓度为500ug/cm2；所述胸腺肽有效浓度为150ug/cm2。作为一种可能方案，所述IL-2、IL-12、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/m和10IU/ml～50IU/m。作为进一步的方案，所述IL-2、IL-12、IL-15的有效浓度分别为1000IU/ml、50IU/ml、20IU/ml。作为一种可能方案，所述IL-2、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、1IU/ml～100IU/ml。作为进一步的方案，所述IL-2、IL-7的有效浓度分别为1000IU/ml、100IU/ml。进一步的，所述NK细胞扩增步骤具体包括：取无血清培养液，加入IL-2配制成扩增培养基，每两天补加扩增培养基，细胞密度维持1～1.5×106个/ml，静置于37℃5％CO2培养箱培养；D14收获细胞，并洗涤计数和检测。作为一种可能方案，所述IL-2的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml。作为进一步的方案，所述IL-2的有效浓度为500IU/ml。进一步的，所述细胞复苏步骤具体包括：(1)在2分钟内，将待复苏细胞从液氮中取出，并立刻转移到37℃水浴锅内快速溶解；(2)将溶解的细胞混悬液转移到，已预热至37℃的5倍体积无血清培养液中，常温下500xg离心，弃上清；(3)加入含10％自体血浆的无血清培养液，按1.0×106个/ml的密度，重悬细胞；(4)重悬细胞后，将细胞放于37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育60min，离心收集细胞。进一步的，所述培养方法(1)将待复苏细胞从液氮中取出，立刻转移到37℃水浴锅内，快速溶解，整个过程不能超过2分钟；(2)将溶解的细胞混悬液转移到，已预热至37℃的5倍体积ALyS505NK-EX培养基中，常温下500xg离心，弃上清；(3)加入含10％自体血浆的ALyS505NK-EX培养基，按1.0×106个/ml的密度，重悬细胞；(4)重悬细胞后，将细胞放于37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育60min，离心收集细胞。所述NK细胞诱导步骤具体包括：Day0，使用CD16、胸腺肽用PBS稀释，进行培养瓶包被，混匀后室温静置60min，加入PBS洗涤一次；Day0取ALyS505NK-EX加入IL-2、IL-12、IL-15配制成诱导培养基，使用诱导培养基将孵育后离心的PBMC按密度2.5～3.0×106个/ml接种到包被好的瓶中，添加10％灭活的自体血浆，静置于37℃5％CO2培养箱培养；Day3，取ALyS505NK-EX加入IL-2、IL-7配制成活化培养基；采用半换液进行补液，将细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法，包括细胞复苏、NK细胞的诱导、NK细胞扩增三个步骤；其特征在于，所述NK细胞诱导步骤具体包括：/nDay0，使用CD 16、胸腺肽用PBS液稀释，进行培养瓶包被，混匀后室温静置60min，加入PBS液洗涤一次；/nDay0取无血清培养液加入IL-2、IL-12、IL-15配制成诱导培养基，使用诱导培养基将孵育后离心的PBMC按密度2.5～3.0×10

【技术特征摘要】
1.一种冻存人PBMC复苏后体外诱导NK细胞的培养方法，包括细胞复苏、NK细胞的诱导、NK细胞扩增三个步骤；其特征在于，所述NK细胞诱导步骤具体包括：
Day0，使用CD16、胸腺肽用PBS液稀释，进行培养瓶包被，混匀后室温静置60min，加入PBS液洗涤一次；
Day0取无血清培养液加入IL-2、IL-12、IL-15配制成诱导培养基，使用诱导培养基将孵育后离心的PBMC按密度2.5～3.0×106个/ml接种到包被好的瓶中，添加10％灭活的自体血浆，静置于37℃5％CO2培养箱培养；
Day3，取无血清培养液加入IL-2、IL-7配制成活化培养基；采用半换液进行补液，将细胞离心后，半换液重悬细胞接种回原瓶，并补加入等量的活化培养基；
Day5和Day7补加活化培养基，使细胞密度维持1.5～2×106个/ml，Day7转到细胞培养袋扩大培养。


2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述CD16有效浓度范围为500ug/cm2～1500ug/cm2；所述胸腺肽有效浓度范围为150ug/cm2～500ug/cm2。


3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述CD16有效浓度为500ug/cm2；所述胸腺肽有效浓度为150ug/cm2。


4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述IL-2、IL-12、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/ml和10IU/ml～50IU/ml。


5.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述IL-2、IL-12、IL-15的有效浓度分别为1000IU/ml、50IU/ml、20IU/ml。


6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述IL-2、IL-7的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、1IU/ml～100IU/ml。


7.根据权利要求6所述培养方法，其特征在于，所述IL-2、IL-7的有效浓度分别为1000IU/ml、100IU/ml。


8.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述NK细胞扩增步骤具体包括：
取无血清培养液，加入IL-2配制成扩增培养基，每两天补加扩增培养基，细胞密度维持1～1.5×106个/ml，静置于37℃5％CO2培养箱培养；
D14收获细胞，并洗涤计数和检测。


9.根据权利要求8所述培养方法，其特征在于，所述IL-2的有效浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔伟圣，蓝欣，何娟娟，陈智妍，
申请(专利权)人：珠海贝索细胞科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44