一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法技术

本发明专利技术涉及一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法，所述复苏液主要成分包含浓度为5g/ml的重组人血白蛋白、浓度为1g/ml的转铁蛋白、浓度为0.365ug/ml的谷氨酰胺、浓度为3.5ug/ml的胰岛素、浓度为0.68mg/ml的维生素B、浓度为0.3g/ml的右旋糖酐、浓度为6.9mg/ml氯化钠、浓度为0.12mg/ml氯化钙。所述复苏液不含血浆，能有效中和DMSO对细胞的毒性作用、分解细胞代谢物、提高细胞的活力、增加细胞膜稳定性，并能提高复苏后的细胞活率，最大限度地恢复至冻存前生物活性，使免疫细胞能有效被诱导活化成目的细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法
本专利技术属于免疫细胞治疗
，涉及一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法。技术背景外周血单核个细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，是一群大颗粒淋巴细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线，也是体外制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等的种子细胞。肿瘤患者在采用细胞治疗时，一般用在手术切除后治疗或者与放疗化疗一起进行治疗。然而，患者在接受手术切除或者放化疗治疗之后，机体的免疫功能低下，并不利用抽血进行细胞体外培养，因此，对于有需要进行细胞治疗的患者，我们需要在手术或者放化疗前进行抽血并保存。且随着细胞储备概念的普及，较多的人选择在自己健康状态良好的时候，冻存部分PBMC，可用于今后亚健康及疾病的治疗。之所以选择冻存PBMC，是因为，PBMC也是体外制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等的种子细胞；其次，NK、CIK等细胞在外周血中所占的比例非常小，如果我们直接对抽取的血液进行保存成本过高；再次，PBMC较易从血液中被分离出来，且被冻存过的PBMC仍具有高效诱导NK、CIK等细胞的能力。对于细胞的保存，细胞冻存是主要方法之一，也是目前最常见的方法。利用冻存技术可以将细胞置于-196℃液氮中进行低温保存，让细胞暂时脱离生长状态但将其细胞的特性保存了起来，这样在我们需要的时候再将细胞复苏用于实验。目前细胞冻存多采用程序降温的方法，慢冻的基本原则，这样可以最大限度的保存细胞活力。二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂，这种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。但由于DMSO具有相当的毒性，细胞复苏后如DMSO去除不净会对病人身体不利。因此需要一款复苏液去除DMSO。复苏细胞则采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。这样冻存复苏过后的细胞，会因冻存液的配制和冻存时间的影响，虽在形态上无明显差异，但在数量上会有较大的损失，且细胞活率较低，对后面细胞的诱导困难。正常情况下，液体解冻时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。为了将复苏过程中细胞的损伤降至最低，需要优化改良复苏液的比例及配方。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法；能够提高复苏后的人PBMC的细胞活力和活率、增加细胞膜稳定性和细胞安全性。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种冻存人PBMC复苏液，主要成分包含重组人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、胰岛素、维生素B、右旋糖酐、氯化钠、氯化钙。作为一种可能方案，所述复苏液主要成分包含有效浓度范围为1-20g/ml的重组人血白蛋白、有效浓度范围为1-10g/ml的转铁蛋白、有效浓度范围为0.2-0.5ug/ml的谷氨酰胺、有效浓度范围为3-10ug/ml的胰岛素、有效浓度范围为0.5-1mg/ml的维生素B、有效浓度范围为0.2-0.5g/ml的右旋糖酐、有效浓度范围为1-10mg/ml氯化钠、有效浓度范围为0.1-0.5mg/ml氯化钙。作为一种可能方案，所述重组人血白蛋白的有效浓度范围为1-20g/ml。作为一种可能方案，所述转铁蛋白的有效浓度范围为1-10g/ml。作为一种可能方案，所述谷氨酰胺的有效浓度范围为0.2～0.5mg/ml。作为一种可能方案，所述胰岛素的有效浓度范围为3～10ug/ml。作为一种可能方案，所述维生素B的有效浓度范围为0.5-1mg/ml。作为一种可能方案，所述右旋糖酐的有效浓度范围为0.2～0.5g/ml。作为一种可能方案，所述氯化钠的有效浓度范围为1-10mg/ml。作为一种可能方案，所述氯化钙的有效浓度范围为0.1-0.5mg/ml。作为一种可能方案，所述复苏液主要成分包含浓度为5g/ml的重组人血白蛋白、浓度为1g/ml的转铁蛋白、浓度为0.365mg/ml的谷氨酰胺、浓度为3.5ug/ml的胰岛素、浓度为0.68mg/ml的维生素B、浓度为0.3g/ml的右旋糖酐、浓度为6.9mg/ml氯化钠、浓度为0.12mg/ml氯化钙。一种利用前述复苏液对冻存人PBMC进行复苏的方法，包括：1、将待复苏细胞从液氮中取出，并立刻转移到37℃水浴锅内在2分钟内快速溶解；2、将溶解的细胞混悬液转移到预先准备好装有5倍体积的复苏液的离心管中，常温下，500×g离心10min，弃上清；3、重悬细胞，用复苏液调整细胞密度为2.0～2.5×106个/ml，放于37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育60min，常温下，500×g离心10min，收集细胞。本专利技术的有益效果如下：1、本专利技术构建的一种冻存人PBMC复苏液及复苏方法，不含血浆，能中和DMSO对细胞的毒性作用、分解细胞代谢物、提高细胞的活力、增加细胞膜稳定性，并能提高复苏后的细胞活率，使细胞能够最大限度的被诱导活化。2、本专利技术所述复苏液所用的成分，不含动物血清及异质源蛋白，也避免病毒、支原体、真菌等细胞污染以及血清批次差异的影响。3、本专利技术复苏方法，将复苏过的人PBMC放置于培养箱中孵育60min能使，复苏细胞状态得到恢复，提高了细胞扩增倍数。【附图说明】图1为实验组和对照组体外NK细胞增殖曲线图；图2为PBMC冻存1个月后采用实验组复苏液培养14天的流式表型图；图3为PBMC冻存1个月后采用对照组方法培养14天的流式表型图；图4为PBMC冻存3个月后采用实验组复苏液培养14天的流式表型图；图5为PBMC冻存3个月后采用对照组方法培养14天的流式表型图；图6为PBMC冻存6个月后采用实验组复苏液培养14天的流式表型图；图7为PBMC冻存6个月后采用对照组方法培养14天的流式表型图。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂厂商购买得到的。本专利技术需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。2、试剂：鲎试剂、除热原吸嘴、除热原空安瓿、内毒素工作标准品(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)，台盼蓝染色液、磷酸盐缓冲液PBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505NK-AC、AL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冻存人PBMC复苏液，其特征在于，所述复苏液主要成分包含重组人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、胰岛素、维生素B、右旋糖酐、氯化钠、氯化钙。/n

【技术特征摘要】
1.一种冻存人PBMC复苏液，其特征在于，所述复苏液主要成分包含重组人血白蛋白、转铁蛋白、谷氨酰胺、胰岛素、维生素B、右旋糖酐、氯化钠、氯化钙。


2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述复苏液主要成分包含有效浓度范围为1-20g/ml的重组人血白蛋白、有效浓度范围为1-10g/ml的转铁蛋白、有效浓度范围为0.2-0.5ug/ml的谷氨酰胺、有效浓度范围为3-10ug/ml的胰岛素、有效浓度范围为0.5-1mg/ml的维生素B、有效浓度范围为0.2-0.5g/ml的右旋糖酐、有效浓度范围为1-10mg/ml氯化钠、有效浓度范围为0.1-0.5mg/ml氯化钙。


3.根据权利要求1所述的复苏液，其特征在于，所述重组人血白蛋白的有效浓度范围为1-20g/ml。


4.根据权利要求1所述的复苏液，其特征在于，所述转铁蛋白的有效浓度范围为1-10g/ml。


5.根据权利要求1所述的复苏液，其特征在于，所述谷氨酰胺的有效浓度范围为0.2～0.5ug/ml。


6.根据权利要求1所述的复苏液，其特征在于，所述胰岛素的有效浓度范围为3～10ug/ml。


7.根据权利要求1所述的复苏液，其特征在于，所述维生素B的有效浓度范围为0.5-1mg/ml。

【专利技术属性】
技术研发人员：孔伟圣，蓝欣，何娟娟，陈智妍，
申请(专利权)人：珠海贝索细胞科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44