一种虫草类产品的鉴别方法及其应用技术

本发明专利技术提出了一种虫草类产品的鉴别方法及应用，通过对不同虫草产品的多糖的单糖组成分析，发现它们之间有显著的差异，故通过对虫草类产品的多糖的单糖组成分析来鉴别虫草的种类，适用于天然虫草、人工发酵虫草和人工伪虫草。对于某一种虫草产品，对其不同的生产批次或者产区的样品做多糖的单糖组成分析，发现没有显著性的差异，故可通过本发明专利技术提供的方法对虫草产品的批次稳定性进行鉴别，控制产品的质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种虫草类产品的鉴别方法及其应用。(二)
技术介绍
本案说述的虫草指的是虫草属的天然虫草、人工伪虫草或者虫草属菌种发 酵的虫草产品。虫草属据不完全统计可能有300多种，英国的CABI Bioscience提供的菌 物名称数据库上可检索到多达497种，但是有一些是同种异名。目前分布在我 国的大约在70种左右。其中最著名的、老百姓普遍认识的是冬虫夏草，拉丁名 是Cordyceps sinensis ( Berk.) Sacc.。我国古医术中记载的虫草一般也是指冬虫 夏草。另外，常见的还有蛹虫草、亚香棒虫草、古尼虫草等等。除了天然虫草 目前市场上常见的还有一些人工虫草制品，这些虫草产品大都是从虫草属的某 一天然虫草子实体中分离得到菌种，而后采用液体或固体人工培养，得到大量 菌丝体或者子实体。比如金水宝的原料就是使用分离得到的蝙蝠蛾拟青霉菌种 液体发酵培养得到的菌丝体，百令胶嚢的原料是蝙蝠蛾被毛孢菌种液体发酵培 养得到的菌丝体，这两个品种均已被2005版《中华人民共和国药典(一部)》 收载。通过菌种发酵得到产品还有宁心宝、至灵胶嚢及虫草头孢菌胶嚢等，还 有种类繁多的各种虫草类保健品，有的是通过菌种发酵而成，有的是固体发酵 培养而成如北虫草。甚至还有一些是人工伪品，有的是通过面粉压模而成，有 的是用黄花菜制作的伪品，五花八门。面对市场上种类繁多的虫草产品，天然的也好，人工发酵培养的也好，人 工伪品也好，没有一个统一的鉴别标准。对于天然虫草目前主要通过外观鉴别， 但是这需要有相当的经验，不容易掌握。对发酵培养的菌丝体产品很难通过外观进行鉴别， 一般对核苷类成分进行鉴别，如百令胶嚢。文献报道的虫草类的 有效成分很多，核苷只是其中之一，且含量很低，比如百令胶嚢中腺苷含量只 有不到千分之一。其中还有很多含量较高的有效成分没有很好的质量控制方法， 比如多糖。如果仅仅对多糖含量进行测定又不具有代表性，因为多糖分布广泛， 很多物质中都含有多糖。本专利技术提供一种方法，通过对各种虫草产品的多糖的 单糖组成进行测定，发现各种虫草产品中多糖的单糖组成有显著差别，而同一 种虫草产品不同产地或者批次多糖的单糖组成差别很小，故此可以用做鉴别标准区别不同的虫草产品；不同批次的同 一发酵产品的多糖的单糖组成基本一致， 可以对同一种虫草产品的质量控制提供可靠的标准。能够作为目前常用的鉴别 方法如外观、核苷类成分、氨基酸鉴别等方法的补充，更好的控制虫草类产品的质量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种虫草类产品的鉴别方法及其用途，通过测定虫草产品的 多糖的单糖组成，结果列成对照表，将待测虫草类产品的多糖的单糖组成与对 照表对照判断待测产品的种属和真假。具体过程如下称取虫草类产品适量，加8倍重量的水回流提取2小时，提取液经离心分 离得到上清液，上清液加4倍体积的无水乙醇沉淀，静置2小时后分离得到沉 淀，沉淀经干燥得到虫草粗多糖。取粗多糖约0. 02克，加入2mol/L的H2S04 溶液2ml，密封，混勻溶解，于125。C反应1小时，放至室温，3500r/min离心 10分钟，上清用4mol/L的NaOH水溶液调pH至7. 0,量取此水解液1. (kl于水 解管中，加入0. 3mol/L Na0H水溶液和0. 5mol/L l-苯基-3-曱基-5-吡哇啉酮的 曱醇溶液各1.0ml，混匀，密封，于70。C水浴中反应30min,取出放冷至室温， 用盐酸调pH至7. 0,加入2ml氯仿萃取，反复3次，水层用0. 45um膜滤过，将过膜后的滤液注入液相色镨仪分析，对比标准品色谱图判断单糖的种类和比例； 液相条件为紫外检测器检测波长250nm， SB-C8反相色谱柱，流动相为pH5. 8 的磷酸盐緩冲液和乙睛以体积比80: 20组成，流速lml/min。收集市面上所有 虫草类产品，分别测其多糖的单糖组成，结果列成对照表，将待测虫草类产品 的多糖的单糖组成与对照表对照判断待测产品的种属和真假。本方法应用之一在于根据不同天然虫草产品多糖的单糖组成有显著差异可 以判断虫草的种属和真假，区别不同种的天然虫草产品。本方法的应用之二在于对于某一种虫草产品，通过对其不同批次间产品的 多糖的单糖组成测定，判断产品的稳定性，作为产品质量控制的指标之一。本方法的应用之三在于虫草发酵类产品之间由于菌种、生产工艺、菌抹的 差异，其产品多糖的单糖组成有显著差异，故可以用来鉴别。虫草产品的原料产地、天然虫草的种类、发酵虫草菌丝体的菌种和菌抹、 发酵虫草菌丝体的发酵工艺等。这些因素都可能导致其多糖的单糖组成差异。 天然冬虫夏草，本身是虫和草的复合体共同入药，故用本法检测时也是整体粉 碎后提取并测定多糖的单糖组成；金水宝和百令胶嚢的原料属于菌种液体发酵 产生的菌丝体，故对金水宝和百令胶嚢的内容物提取多糖并测定组成。同一菌 种的不同菌林发酵得到的菌丝体产品，其多糖的单糖组成也不尽相同，比如华 东医药有限公司生产的百令胶嚢和浙江赐富医药有限公司生产的蝙蝠蛾被毛孢 菌丝体粉的菌种都是蝙蝠蛾被毛孢，但是菌抹不同，工艺也稍有差异，结果两 者产品的多糖的单糖组成差异明显，故本测定方法的分辨率还是比较高的。如 果用DM方法进行测定，则不同菌抹同一菌种的DM测定结果必定是一致的， 无法区别。故本鉴定方法可以作为虫草产品质量控制的标准之一。而对于同一 个虫草产品，通过本方法测定每一个批次产品的多糖的单糖组成，可以鉴别不同批次产品的差异，若结果相同表明产品质量稳定，若结果有显著差异则表明产品质量不够稳定。在这一点上相比使用目前权威的DNA鉴别技术有突出的优 点，DNA技术只能对菌种进行差别，不同菌种的DNA不同，比如蛹虫草和冬虫夏 草的DNA有显著差异，但是对于同一菌种不同批次的产品则无法确定产品的稳 定性。而本方法对多糖的单糖组成测定不仅反映了不同菌种的差异，而且还反 应出了整个发酵过程是否稳定。因为多糖的单糖组成不仅和菌种有关，还和整 个生产过程有关。但是，本方法的作用也不是绝对的，不能认为本方法可以取 代DNA鉴别和其他非糖组分的理化鉴别等方法。这些方法之间是互相补充的， 各有各的优点，本方法是对其它方法的一个补充。对于天然的虫草产品，不同菌种的虫草产品多糖的单糖组成差异显著，但 是同一菌种的产品不同产地则多糖的单糖组成差异不显著。对于发酵培养产品 不同菌种、同菌种不同菌^^朱等都会导致产品的多糖的单糖组成差异显著。对于 人工伪虫草则与制造伪虫草的原材料有关。 具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不 仅限于此 实施例1:称取天然冬虫夏草、蛹虫草、亚香棒虫草和人工伪虫草各约l克，加10倍 重量的水回流提取2小时，提取液经离心分离得到上清液，上清液加4倍体积 的无水乙醇沉淀，静置2小时后分离得到沉淀，沉淀经干燥得到虫草粗多糖。 取粗多糖约O. 02克，加入2mol/L的H2S04溶液2ml，密封，混匀溶解，于125 。C反应1小时，放至室温，3500r/min离心10分钟，上清用4mol/L的NaOH水 溶液调pH至L 0，量取此水解液1. Oml于水解管中，加入0. 3mol/L Na0H水溶液和O. 5mol/L 1-苯基-3-曱基-5-吡唑啉酮的曱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种虫草类产品的鉴别方法，其特征在于：称取虫草类产品适量，加８倍重量的水回流提取２小时，提取液经离心分离得到上清液，上清液加４倍体积的无水乙醇沉淀，静置２小时后分离得到沉淀，沉淀经干燥得到虫草粗多糖。取粗多糖约０．０２克，加入２ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］溶液２ｍｌ，密封，混匀溶解，于１２５℃反应１小时，放至室温，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０分钟，上清用４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ水溶液调ｐＨ至７．０，量取此水解液１．０ｍｌ于水解管中，加入０．３ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ水溶液和０．５ｍｏｌ／Ｌ１－苯基－３－甲基－５－吡唑啉酮的甲醇溶液各１．０ｍｌ，混匀，密封，于７０℃水浴中反应３０ｍｉｎ，取出放冷至室温，用盐酸调ｐＨ至７．０，加入２ｍｌ氯仿萃取，反复３次，水层用０．４５ｕｍ膜滤过，将过膜后的滤液注入液相色谱仪分析，对比标准品色谱图判断单糖的种类和比例；液相条件为：紫外检测器检测波长２５０ｎｍ，ＳＢ－Ｃ８反相色谱柱，流动相为ｐＨ５．８的磷酸盐缓冲液和乙睛以体积比８０∶２０组成，流速１ｍｌ／ｍｉｎ；收集市面上所有虫草类产品，分别测其多糖的单糖组成，结果列成对照表，将待测虫草类产品的多糖的单糖组成与对照表对照判断待测产品的种属和真假。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳伟，柴黎燕，欧阳小军，张萍，傅惠英，柯传奎，杨勇杰，
申请(专利权)人：柯传奎，杨勇杰，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]