使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法，优选地，涉及一种基于导致恙虫病的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamoshi)的多拷贝基因的碱基序列而提供的引物对(primer pair)，以及使用其检测恙虫病东方体以诊断恙虫病的方法。使用本发明专利技术的引物对的诊断方法比使用常规的靶基因的检测方法可以以更高的灵敏度和特异性进行检测，因此可以以高的准确度快速且容易地进行临床诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法
本专利技术涉及一种使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法，优选地，涉及一种能够扩增恙虫病东方体(Orientiatsutsugamoshi)——恙虫病的致病菌——的多拷贝基因的碱基序列的引物，以及使用所述引物诊断恙虫病的方法。
技术介绍
恙虫病是一种急性发热性疾病，其由被恙虫病东方体感染的恙螨科幼虫感染，并且显示出以全身性血管炎为特征的临床表现。主要宿主是啮齿类动物，螨类动物既是宿主也是介体。自从1951年在韩国首次将其作为一种主要的秋热病报道以来，该病在韩国在9月至11月之间发生。尤其是，在韩国是一种常见病，因为在秋季30％的患者被诊断为恙虫病。症状包括被受感染的螨幼虫叮咬后，经过1-3周的潜伏期后，初期症状伴有发烧、发冷、头痛和肌肉疼痛，在胸部、腹部、躯干或上下肢以及极少情况下在脸部或在手掌、足底出现红斑和丘疹。发病几天内在受感染的螨叮咬的皮肤上出现黑色痂覆盖的焦痂(eschar)，在大多数情况下，没有诸如疼痛或瘙痒的症状，焦痂的确认有助于快速诊断。通常，该病程并不严重，并且对抗生素治疗反应良好，但是延迟诊断可能导致肺炎、急性肾衰竭、脑膜炎、脑炎、上消化道出血、多器官功能障碍综合征、甚至心肌炎或中风。这种并发症可能会导致某些患者死亡。因此，快速准确的诊断对于改善患者的预后至关重要。诊断恙虫病的方法包括：培养、分离来自患者的血液的恙虫病东方体、并在患者的血清中检测针对恙虫病东方体的抗体的方法。但是，通过培养菌体诊断疾病的方法需要数周以上的培养时间，对于诊断实际患者的目的并不合适。在诊断中最常用的检查方法是间接免疫荧光抗体法(IFA)、被动血集反应(PHA)和免疫色谱法(Immonochromatography)。使用这些抗体的诊断方法通常在症状发生1-2周以后被检出，因此，灵敏度非常低，且假阳性多，无助于诊断。例如，参考图1，使用间接免疫荧光抗体法(IFA)诊断恙虫病的方法是疾病预防控制中心公开的方法之一，其在当IFAIgG抗体滴度为1∶256以上时就判定为确诊恙虫病。但是，抗体上升并被诊断可能需要数周，并且46.7％的灵敏度相对较低，如果在症状发生1周内就医，只有所有患者的42.1％可以被诊断为恙虫病，因此需要更加快速且容易判定的新的诊断方法。作为替代的诊断方法，已经提出了基于聚合酶链反应(PCR)的检测方法。PCR是一种可以指数地扩增DNA所需部分的拷贝(copy)数的分子生物学方法。不管是DNA的任何部分，只要知道其序列，则可以通过PCR进行扩增。PCR方法包括以常规方式进行的常规(conventional)PCR，从常规方法改进的并且比常规PCR方法灵敏100倍的嵌套式(nested)PCR方法、以及可以实时监测(monitoring)PCR反应并且可以在2小时的短时间内确认结果的实时定量荧光(realtime)PCR方法。通常，在恙虫病的PCR诊断方法中，已经尝试了使用诸如46kDa、57kDa、groEL的各种靶蛋白基因(targetproteingene)的PCR，并且主要使用嵌套式PCR和实时PCR，而不是常规PCR。在恙虫病的诊断中常规PCR的灵敏度极低，在10％内。在嵌套式PCR的情况下，可以通过进行两次PCR来提高灵敏度，但存在着比别的PCR所需的检查时间更长的缺点以及由于进行两次PCR，由基因的污染(contamination)导致假阳性率增加的缺点。虽然有通过执行实时监测PCR反应的实时定量荧光PCR的快速诊断的方法，但是由于检查设备非常昂贵，因此难以在医疗机构中普遍使用。因此，急需开发在显示出高灵敏度和特异性的同时通常简单且费用少的诊断方法。
技术实现思路
技术问题本专利技术是为了解决上述问题而提出的，本专利技术的最大目的在于，提供一种使用恙虫病东方体菌的多拷贝基因来诊断恙虫病的方法。优选地，本专利技术的目的在于，提供了一种使用能够扩增多拷贝基因的碱基序列的引物对来诊断恙虫病的方法。另外，本专利技术的第二个目的在于，提供了一种包括特定碱基序列的引物对。另外，本专利技术的第三个目的在于，提供了一种包括由特定碱基序列组成的引物对的PCR诊断试剂盒。优选地，本专利技术的目的在于，通过提供一种由灵敏度和特异性优异的特定碱基序列组成的引物对来提供一种能快速诊断恙虫病菌的PCT诊断试剂盒。问题的解决方案为了实现上述的第一个目的，本专利技术公开了包括能够扩增恙虫病东方体菌的多拷贝基因的碱基序列的特定碱基序列的引物。本专利技术的引物包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的1种以上的碱基序列。优选地，本专利技术的引物对包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的2种以上的碱基序列。更优选地，所述引物对可以包括序列号1和序列号2的碱基序列。为了实现本专利技术的第二个目的，本专利技术的恙虫病的诊断方法可以使用能够扩增多拷贝基因(multicopygene)的碱基序列的引物对进行检测。所述诊断方法可以包括以下步骤：(a)从样本分离DNA的步骤；(b)以所述分离的DNA为模板，使用序列号1至序列号36的引物对执行PCR的步骤；以及(c)分离所述PCR产物的步骤。为了实现本专利技术的第三个目的，恙虫病诊断用PCR试剂盒可以包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的引物对。专利技术效果根据本专利技术的包括特定碱基序列的引物对对于多拷贝基因具有高特异性。另外，根据本专利技术的诊断恙虫病的方法使用包括特定碱基序列的引物对通过PCR反应以高的灵敏度和特异性进行检测，因此可以以高的可靠性快速且容易地进行临床诊断。附图说明图1是使用间接免疫荧光抗体法的诊断方法的检测灵敏度图。图2是示出使用根据本专利技术的PCR检测方法的恙虫病诊断方法的流程图。具体实施方式下面详细描述本专利技术。本专利技术的恙虫病诊断方法是使用能够扩增恙虫病东方体菌的多拷贝基因的碱基序列的引物对进行检测。所述多拷贝基因(multicopygene)指的是在恙虫病东方体基因内的多个位置处重复存在的基因，优选地，可包括14种Tra连锁(Tra-linked)基因的碱基序列，更优选地，可包括traB、traE、traC以及TchA基因的碱基序列。另外，所述多拷贝基因是PCR的靶基因(Targetgene)。在常规的诊断方法中使用的诸如47kDa、56kDa、groE1-STG的靶蛋白基因只存在于整个基因中的一个位置，然而，多拷贝基因重复存在于多个位置，从而使得在执行PCR扩增碱基序列时PCR效率提高，因此可以提高恙虫病诊断的准确度。本专利技术的恙虫病诊断用引物包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的1种以上的碱基序列。另外，本专利技术的恙虫病诊断用引物对包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的2种以上的碱基序列。所述引物对可以包括序列号1和序列号2的碱基序列。...

【技术保护点】
1.一种恙虫病诊断方法，其特征在于，使用恙虫病东方体(Orientia tsutsugamoshi)菌的多拷贝基因(multicopy gene)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180108 KR 10-2018-00022821.一种恙虫病诊断方法，其特征在于，使用恙虫病东方体(Orientiatsutsugamoshi)菌的多拷贝基因(multicopygene)。


2.根据权利要求1所述的恙虫病诊断方法，其特征在于，使用能够扩增所述多拷贝基因(multicopygene)的碱基序列的引物对进行检测。


3.一种恙虫病诊断用引物，其特征在于，包括选自由序列号1至序列号36的碱基序列组成的组的1种以上的碱基序列。


4.一种恙虫病诊...

【专利技术属性】
技术研发人员：金东民，
申请(专利权)人：朝鲜大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR