微生物菌株及其用途制造技术

本发明专利技术涉及在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失的假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株可以用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。优选的糖醇是木糖醇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微生物菌株及其用途
本专利技术涉及假丝酵母(Candida)菌株，所述假丝酵母菌株可用于由一系列木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。当存在麦芽糖作为共底物时，所述菌株特别适合低阿拉伯糖醇水平和高木糖醇水平。
技术介绍
鉴于源自农业、林业和农用工业废物的木质纤维素生物质在全球的丰度、广泛可用性以及碳中性可再生性质，它们是技术开发的重要渠道。通常，直链结晶纤维素占植物生物质的大部分，随后是支链非结晶杂聚半纤维素以及支链木质素。为了改善木质纤维素生物质平台的经济可行性并推动其广泛的商业吸收，至关重要的是设计整体方法，以从大多数生物质组分中生成增值产品。到2020年，预计天然甜味剂木糖醇每年的市场为10亿美元，并且在多元醇市场中所占份额为12％，是从半纤维素木糖中获得价值的诱人候选者。木糖醇是戊糖醇类型的糖醇，因其血糖指数低，减少蛀牙(etal.2005)、预防急性中耳炎(Uhari,M.,Kontiokari,T.&Niemela1998)和增强骨密度(Satoetal.2011)的功效而在膳食食品、制药和牙科行业广泛作为添加剂使用。目前，使用雷尼镍催化剂通过木糖氢化来实现木糖醇商业生产。除了由于需要纯化的木糖(作为底物)和高温而导致成本和能源密集型外，此类化学处理在环境上是不可持续的，并且由于需要高压氢气和有毒催化剂而通常需要额外的防护措施(Jeonetal.2011)。结果，许多研究探索了通过使用天然存在的木糖同化型酵母或通过使来自真核和原核域的模型物种工程化来生产木糖醇的生物技术手段。但是，商业过程仍然难以实现。酸催化的蒸汽爆炸通常涉及在压力下用过热蒸汽处理弱酸浸渍的木质纤维素然后突然减压，使半纤维素骨架由于其分子量低和无定形结构而容易水解。尽管这导致释放锁定在纤维中的半纤维素糖(主要是戊糖和残留的己糖部分)，但木质纤维素预处理不可避免地造成产生次级副产物，该次级副产物在以高浓度存在时，会极大地抑制微生物的生长表型和整体发酵潜力。通常，采用酸性条件可能导致释放出的戊糖和己糖脱水，分别形成糠醛(2-糠醛)和5-羟甲基-2-糠醛(HMF)。苛刻的工艺条件(例如蒸汽爆炸过程中的酸浓度升高或高温)可形成进一步的降解产物，例如脂肪族羧酸(例如乙酸、甲酸、乙酰丙酸)和酚类衍生物(香草醛、丁香醛、香豆酸和阿魏酸)。已经提出了许多策略来抵消通过木质纤维素水解产物中各种抑制性化合物之间的协同作用产生的增强的毒性(etal.2013进行了评论)。这些包括汽化、酶处理、使用还原剂、液-液相互作用、以及也许最常用的涉及用活性炭处理液-固相互作用(etal.2013)。然而，这些方法中的大多数都具有固有的缺陷。除了添加对工艺经济性和操作时间有不利影响的另一个工艺步骤外，解毒过程还几乎总是导致糖浓度降低，这必然会降低产品滴定度，进而降低工艺生产率。在欧洲，小麦秸是容易获得的农业原料的例子，每年超过5亿吨的可获得量使得小麦秸成为世界上最主要的之一。小麦满足全球20％以上人口的粮食需求，而需求增加可能会导致未来产量增加，从而确保小麦秸原料的稳定供应。通常，小麦秸中的半纤维素含量往往约为其干重的20％至25％(Prasadetal.2007)，主要由木糖和显著量的阿拉伯糖组成。原料的顽拗性(recalcitrance)较低使得能够使用较温和的预处理条件来释放糖，特别是半纤维素，导致降低蒸汽爆炸的水解产物中抑制剂的含量。在大多数酵母和天然真菌中，包括假丝酵母进化枝的成员，D-木糖的代谢遵循酶促氧化还原途径，其中D-木糖首先通过木糖还原酶(XR)还原为木糖醇，然后木糖醇通过木糖醇脱氢酶(XDH)氧化为D-木酮糖。D-木酮糖在ATP依赖性反应中通过木酮糖激酶的作用进一步转化为木酮糖-5-磷酸，然后通过戊糖磷酸途径进入中心细胞代谢。XR和XDH都需要辅因子，尽管是不同的辅因子，来催化它们各自的反应。尽管来自大多数假丝酵母物种的XR要么仅利用NADPH作为辅因子要么比起NADH更偏好于利用NADPH，但XDH主要依赖NADH。在酵母中，NADPH和NADH的胞内水平与对于木糖途径酶NADPH和NADH的可用性之间通常存在不一致，随之而来的氧化还原失衡是木糖醇生产的主要原因之一。除木糖外，XR还可以结合作为底物的木糖差向异构体阿拉伯糖，随后将阿拉伯糖转化为扰乱发酵后的木糖醇纯化的杂质阿拉伯糖醇。尽管许多报告集中于在模型酵母中引入和增强木糖向木糖醇生物转化的代谢工程化策略的应用，但探索热带假丝酵母(C.tropicalis)基因操作以提高木糖醇产量的研究相对有限。Ko等人(2006)首次证明热带假丝酵母突变体中木糖醇滴定度提高，该突变体中破坏了两个XYL2拷贝以完全消除XDH活性。虽然作者可以实现理论最大收率，但缺失菌株通常需要大量甘油作为共底物以辅助细胞维持和NADPH再生(每克木糖多达0.4克甘油)(Koetal.2006)，这一要求不仅对工艺经济性不利，而且由于存在额外的多元醇，系统中任何残留的甘油都可能扰乱下游纯化(Koetal.2011)。随后，尽管以转化收率从理论最大值100％降低至75％为代价，通过采用定点诱变使XDH活性降低60％从而更进一步减慢了来自XDH的碳流量，消除了对共底物的需求(Koetal.2011)。结合甘油使用，最近的研究旨在通过以下方式来提高木糖醇形成速率：改善细胞中NADPH的可用性以及因此通过戊糖磷酸途径的通量(Ahmadetal.2012)；或将内源性热带假丝酵母甘油激酶基因替换为来自树干毕赤酵母(S.stipitis)的一系列甘油代谢基因以增加甘油利用速率(Ahmadetal.2013)。虽然上述研究中使用实验室菌株可能使微生物工程化更容易，并且首次窥见工程化热带假丝酵母的特性(尽管仅在合成培养基中)，但是关于菌株的抑制剂耐受性以及工艺整体放大的信息的缺乏阻碍了该技术的直接商业应用。本专利技术的目的是鉴定和/或开发能够使木糖到木糖醇的生物转化最大化的微生物菌株和方法。如果这样的菌株和方法可以在发酵过程中使浪费的阿拉伯糖醇产量最小化或消除，则将是优选的。此外，期望有使用容易获得的木质纤维素原料的菌株和方法将是期望的。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失。该菌株优选缺失第一和/或第二XYL2等位基因。假丝酵母菌株可以涵盖若干如权利要求1或2所要求的，其中假丝酵母菌株包括若干不同的菌株。优选地，假丝酵母菌株可以包括热带假丝酵母(Candidatropicalis)NCYC4185或热带假丝酵母NCYC4186或热带假丝酵母NCYC4190或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4187或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4188或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4189或其突变体或衍生物。在相关方面，优选假丝酵母菌株用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。假丝酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170824 GB 1713622.71.假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失。


2.根据权利要求1所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述菌株缺失第一和/或第二XYL2等位基因。


3.根据权利要求1或2所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述假丝酵母菌株包括热带假丝酵母NCYC4185或热带假丝酵母NCYC4186或热带假丝酵母NCYC4190或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4187或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4188或Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC4189或其突变体或衍生物。


4.根据前述权利要求中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述假丝酵母菌株用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。


5.根据权利要求4所述的假丝酵母菌株，其特征在于，生产的所述一种或多种糖醇包括木糖醇。


6.根据权利要求5所述的假丝酵母菌株，其特征在于，生产的所述一种或多种糖醇包括木糖醇和阿拉伯糖醇。


7.根据权利要求6所述的假丝酵母菌株，其特征在于，相比第一和/或第二XYL2等位基因中没有突变或缺失的菌株，生产的所述一种或多种糖醇具有更高的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例。


8.根据权利要求7所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例大于约2.0倍。


9.根据权利要求8所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约2.7倍。


10.根据权利要求7所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约4:1或更高。


11.根据权利要求10所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例在发酵时间24小时后比在发酵时间48小时后更高。


12.根据权利要求4至11中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述一种或多种糖醇在麦芽糖作为共底物存在的工艺中由木质纤维素原料产生。


13.根据权利要求12所述的假丝酵母菌株，其特征在于，在所述工艺中或所述工艺的过程中，所述麦芽糖作为主要的共底物存在，并且不存在甘油共底物或仅存在少量的甘油共底物。


14.根据前述权利要求中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述菌株已经被修饰以表达外源淀粉酶。


15.根据权利要求4至14中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木质纤维素原料包括啤酒糟(BSG)和/或小麦秸水解产物。


16.根据权利要求15所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木质纤维素原料包括通过使弱酸浸渍的小麦秸经蒸汽爆炸而产生的未脱毒木质纤维素水解产物。

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【专利技术属性】
技术研发人员：阿布舍克·索马尼，大卫·尼尔·布莱恩特，斯里尼瓦斯·拉奥·拉韦拉，约瑟夫·安东尼·加拉赫尔，纳尔奇斯·费尔南德斯福恩特斯，
申请(专利权)人：阿伯里斯特维斯大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB