胃癌的淋巴结转移的检测制造技术

本发明专利技术涉及一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法、组分和制品，其对阴性淋巴结和具有胃癌转移的淋巴结进行区分，检测组织样品以确定胃癌阶段性状态。

【技术实现步骤摘要】
胃癌的淋巴结转移的检测^e每年约有876,000新发胃癌病例(Shibuy^ Mathere等人，2002)。在 美国，2005年胃癌的估i愤发病例和死亡人数分别为21,860和11,550 (Jemal, Murray等人，2005)。胃部恶创巾瘤是胃癌的最常见类型(90%至95%),按 照发病率次序其紧随淋巴瘤、，瘤和间,形细胞瘤之后(Kumar, Cotran等 人2003)。彻底的局部区域控制是挽救胃癌患者的主要治疗方法，其包括胃^t刀除术 或胃次全切除术、标记淋巴结清除术、扩展淋巴结清除斜卩受转移影响的邻近 组织切除例如脾切除斜Q胰腺切除术(Hartgrink和van de Velde 2005; Kitagawa^ Fujii等人，2005)。在手术治疗后遭受复发的所有患者中，高达87.5%的是由 局部錢顿ij余局部淋巴结转移弓胞的(Songui^Bonenkamp等人，1996)。在一项涵盖148个胃一錄连接部(GEJ)癌患者的调查研究中，人们得 出的结论是局部淋巴结内微转移的存在是预后不良的关谢旨示(Heer叫Kelder 等人，2005)。目前胃癌的淋巴结转移的普遍分期/诊断JtM过触诊和手术中冰 冻切片检查实现的。淋巴结的冰冻切片检查可以显示74%的灵敏度(Kitagawa^ Fujii等人，2005)。利用适当的基因标记物，基因表达分析和检测技术例如逆转录酶PCR (RT-PCR)或定量PCR可以提供一种可选择的用于胃癌的诊断或预后的方法。 这些方法有可能提供更好的用于转移检测K^的灵敏度和精确度。先辦艮道的 基因标记物包括CK19 (Matsuda^ Kitagawa等人，2004)、癌胚抗原(CAE)、 细胞角蛋白-20 (CK-20)、和MAG&3 (Okada^ Fujiwara等人，2001)、 CK18、 MUC1、 hTRT (Ajisaka和Miwa， 2003)。不幸的是，如同公布的数据显示的， 它们中的大部分在检测的所有肿瘤组织和肿瘤细胞系内不能一^达。禾拥逆 转录酶PCR不能在组织学检查确认的15% (CEA)到70%以上(MAG&3) 的具有胃癌转移的淋巴结中检测到标记物(Okada^Fujiwara等人，2001)。 CK-20 t細作丰^ia物用于M、结肠、胃、禾,癌的血液内播散的癌细胞的逆转录酶PCR检测(Chausovsky，Luchansky等人，1999; Ch叫Chen等人，2004)。在这里，鉴定了 一种标记物组合其以可轻易检测的水平在具有胃癌转移 的淋巴结内一致表达，这种可检测的水平在正常的淋巴结内可与其背景表达区 分开来。这种标记物组合可用于检测来自胃癌、或對,胞来源的癌，例如食 道癌、胰腺癌和肠癌的M^性癌细胞。
技术实现思路
在本专利技术的一方面中，组合使用一组标记物以检测来自胃癌的淋巴结转 移。在具有胃癌转移的淋巴结中，这些1^HB物的表ii7jc平显著高于正常淋巴结 的表达水平。标记物组合为CK19、 CEA和MUC-2标记物。在本专利技术的另一方面中，诊断胃癌的淋巴结转移包括从患者中获取生物 学样品并测定选自标记物组的基因表达水平，其中皿预定临界水平的基因表ii^平则表明胃癌转移。^m地，生物学样品为淋巴结样品。在本专利技术的另一方面中，标记物被组合用于检测胃癌的淋巴结转移的方法中。仍然在本专利技术的另一方面中，在手术中分析标记物。可以通过一种方法 进行手术中分析，该方法包括如下步骤制备从胃引出的淋巴结的RNA;实 施针对一个或多个标记物的定量RT—PCR方法并确定出现的标记物是否超出 预定截断值。本专利技术包括用于实施这里提供的方法的微阵列驢因芯片，还有进摘分 析的试剂盒和制品。该说明书中所描述和要求保护的专利技术方法、组分、制品、和试剂盒包括 ^HS物的组合。^H^明书中所使用的"^HS物"是指a) 基因和基因表达产物，例如mRNA和相应cDNA、肽、蛋白质，±M每种物质的片段和补体，和b) 组分例如探针、抗体、配体、半抗原、和标记物，其ffi31与a)的物 理或化学相互作用表明基因的,或基因表达产物的存在，并且其中该基因、 基因敬产物或组分对应于SEQ ID NO NM_002276、 SEQ ID NO NM—002457、 和SEQ ID NO Ml 7303。如果基因包含那鹏列则其对应于SEQ ID NO所指示的序列。如果基因 ,产品的区段(segment)或片断(fegment)包含足以区分其为该基因或基因表达产品的序列的一部分参考基因表达产品，卜体,则该区段或片段相应于该基因或基因表达产品的序列。另外如果基因^ii产物的RNA、 mRNA、或 cDNA与具有这种序列的组分(例如探针)杂交，贝條基因表ii^也如前述 那样对应于这种序列，^在所述产物J1I太或蛋白质的情况下,其由这种mRNA 编码。当基因表达产物区段(segment)或片段(fiagment)包含足以区分其为 该基因序列或基因鋭产物的部分参考基因表达产物或其互丰唯时，则该基因 表达产物区段(segment)或片段(fragment)也对应于这种基因序列或基因表 达产物。本专利技术的标记物对应于编码三个已知蛋白的基因癌胚抗原(SEQIDNO M7303X粘蛋白2 (SEQ ID NO NM—002457)、和细胞角蛋白19 (SEQIDNO NM—002276)。当它们各自用作癌标记物时这些基因不能使分析具有可接受的 功效，尤其是对于在手术中使用。但是，以组合方式，如同实施例中显示的， 这些*祝物提供了灵敏和特异性的检测以确定胃癌转移。通常还会分析对照品 以确保阴性结果并非产生自分析中所产生的错误。组成性表达的基因例如 PBGD (SEQ ID NO NM_000190)在这方面是有用的并且用于分析它们的试剂 ttii包括在试剂盒组分内。雌PBGD是因为，其中，在人体中它不包含已知 的假基因、它组成性表达于人体组织并且它以相对低的7K平^ii而且因此很少 会引起感兴趣的目标序列扩增的抑制。样品制备一般包括操作切除的组织，im淋巴结组织。组织中转移和微 转移的分布在淋巴结或其它组织中并不一致。因此，应当获TO够大的样品使 得不会漏掉转移。在目前的方法中一种样品釆集方法是匀质化大组织样品，随 后采用适当部分的组织匀浆以制备用于好检湖啲RNA。本专利技术方法中采用的样品tt^为来自从胃引出的淋巴结的淋巴结样品。 接着是制备这种用于RT—PCR分析的样品的有用步骤；OT Omni匀浆器和 —次性探针用于匀浆后再用Rneasy (Qiagen)试剂盒试剂纯化RNA:a) 如果之前没有记录，以毫克确定样品重量。将一张新的蜡自置在天 平上、校准并秤量样品。,淋巴结样品^3l30mg。b) 禾i佣新的手术刀，将同一淋巴结的所有组织切碎雌^^勺4mm的块。 注意在处M程中避免污染组织。c) 将匀化(RLT)缓冲、鄉卩到聚丙烯匀化管中。每100mg组织雌舰2ml匀化缓冲液。d) 禾佣干净的镊子，将组织转移到匀腿冲液内。e) 将新的匀化Mimg在AX匀浆器上。f) 完^J化旨淋巴结。g) 按标准Qiagen规程中的齡RNA纯化步骤鹏组织匀浆，在鹏前 将RNA存储在一65'C^M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法，包括以下步骤：ａ）从患者获得生物学样品，和ｂ）检测样品中的标记物水平；其中高于预定截断水平的水平表明胃癌的淋巴结转移。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：SW曹，G格林，J琼斯，M徐，
申请(专利权)人：维里德克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]