一种大葱种质资源创制和分析方法技术

本发明专利技术公开了一种大葱种质资源创制和分析方法，有以下步骤：(1)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取待选大葱基因组DNA；(2)设计、筛选大葱多态性SSR引物；(3)利用PCR扩增待选种质基因组DNA；(4)待选种质进行遗传多样性背景分析；(5)结合田间形态表现和遗传多样性表现选定目标种质，制定种植资源利用策略；(6)田间栽培选定目标性状种质，调整用于杂交组合配置的亲本花期，进行人工授粉；(7)收获杂种F1，进行性状鉴定。本发明专利技术的SSR标记多态性水平高、操作简单、重复性和稳定性较好，采用STR检测可以在分子水平上直观的表现出遗传差异，能提高大葱育种种质资源的选择效率。

【技术实现步骤摘要】
一种大葱种质资源创制和分析方法
本专利技术涉及生物育种
，特别涉及一种大葱种质资源创制和分析方法。
技术介绍
我国具有丰富的大葱种质资源，而独特的高原生境也是大葱种质资源利用与创新的良好环境，目前国内大葱产区主栽以日本钢葱、章丘大葱系列葱为主。很多地方品种因各种原因种植面积逐渐下降，面临丰富的葱遗传背景资源逐步丢失的问题。目前大葱育种工作多集中在引种栽培、自然变异、诱变变异、定向选择、杂种优势利用等方式。大葱种质资源利用与新品种选育中资源纯化、杂交、定向选择工作量大、时间长、杂交后代性状表现分散，较好的性状聚集难度大；资源利用受环境条件和气候因素的影响较大，方向性不明确，且资源创新利用、新品种选育难度较大。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一种能有效提高种质资源利用和杂交育种的准确性的大葱种质资源创制和分析方法。本专利技术的技术方案如下：一种大葱种质资源创制和分析方法，有以下步骤：(1)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取待选大葱资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织提取基因组DNA。(2)设计、筛选大葱多态性SSR引物。(3)利用PCR扩增待选种质基因组DNA。(4)待选种质进行遗传多样性遗传背景分析。(5)结合田间形态表现和遗传多样性表现选定目标种质，制定种植资源利用策略。(6)田间栽培选定目标性状种质，调整育种策略中配置杂交组合的亲本花期，使其适期相遇，进行人工授粉。(8)收获杂种F1，进行性状鉴定。进一步地，所述步骤(1)中采用试剂盒提取待选大葱资源基因组DNA的步骤为：3)取样备选种质资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织2-3g。4)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取DNA，检测OD260/OD280比值在1.8-1.9。3)稀释DNA模板浓度至20-50ng/μl。进一步地，所述步骤(2)中的设计和筛选步骤为：1)利用PrimerPremier5.0,NCBI及前人研究设计SSR引物38对。2)随机选择4个样品，进行SSR多态性引物筛选，获得多态性较好的10对引物。进一步地，所述步骤(3)的扩增基因组的步骤为：1)采用25ulPCR反应体系，20-50ng/μl模板1ul，10μM引物F1ul，10μM引物R1ul，10μMdNTP(mix)1ul,10*buffer(withMgCl2)2.5ul,5U/ulTaq酶0.5ul,ddH2O至25ul。2)在95℃预变性3min；94℃变性30S,60℃退火30S,72℃延伸30S，循环2-4,10个循环；94℃变性30S,55℃退火30S,72℃延伸30S，循环6-8,35个循环；72℃修复延伸5-8min，扩增待测种质基因组DNA。进一步地，所述步骤(4)中得分析步骤为：1)采用步骤(2)中筛选的多态性较好的引物或引物组合。2)采用STR检测进行遗传多样性分析。确定STR位点，进行荧光标记选择，筛选的多态性引物合成和标记，荧光分子量内标的选用。3)PCR产物通过ABI3730XL测序仪器进行毛细管电泳检测，获得扩增片段大小的数据。4)采用GeneMapper3.2软件进行种质资源数据处理分析资源多样性及差异表达。进一步地，所述步骤(5)按照育种目标性状，结合田间性状筛选出相关的种质材料，分析遗传多样性表现，选择适合的品种资源用于育种目标性状改良。进一步地，所述步骤(6)的操作方法为：田间栽培选定目标性状种质，调整育种策略选定亲本材料，使其亲本花期相遇，进行人工授粉，以便配置杂交组合，进行预期目标性状的选择。有益效果：本专利技术的SSR标记多态性水平高、操作简单、重复性和稳定性较好，能检出较好的多样性，采用STR检测可以在分子水平上直观的表现出遗传差异，可有效精准地提高大葱育种种质资源的选择效率。附图说明图1为采用荧光标记引物AFS099-1，大葱A42样品毛细管电泳检测的光谱图。图2为采用荧光标记引物AFS099-1，小香葱B1样品毛细管电泳检测的光谱图。图3为采用荧光标记引物AFS099-1，小香葱B2样品毛细管电泳检测的光谱图。图4为采用荧光标记引物AFS099-1，鸡腿红葱早分样品Ba2毛细管电泳检测的光谱图。图5为采用荧光标记引物AFS099-1，鸡腿红葱中分样品Bb2样品毛细管电泳检测的光谱图。图6为采用荧光标记引物AFS103，小香葱B1样品毛细管电泳检测的光谱图。具体实施方式现对本专利技术作进一步说明：(1)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取16份待选大葱资源10个单株的新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织提取基因组DNA。其具体步骤为：1)取样备选种质资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织2-3g。2)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取DNA，检测OD260/OD280比值在1.8-1.9。3)稀释DNA模板浓度至20-50ng/μl。(2)设计、筛选大葱多态性SSR引物。其具体步骤为：1)利用PrimerPremier5.0,NCBI及前人研究设计SSR引物38对。2)随机选择4个样品，进行SSR多态性引物筛选，获得多态性较好的10对引物，如：(3)利用PCR扩增待选种质基因组DNA，其具体步骤为：1)采用25ulPCR反应体系，20-50ng/μl模板1ul，10μM引物F1ul，10μM引物R1ul，10μMdNTP(mix)1ul,10*buffer(withMgCl2)2.5ul,5U/ulTaq酶0.5ul,ddH2O至25ul。2)在95℃预变性3min；94℃变性30S,60℃退火30S,72℃延伸30S，循环2-4,10个循环；94℃变性30S,55℃退火30S,72℃延伸30S，循环6-8,35个循环；72℃修复延伸5-8min，扩增待测种质基因组DNA。(4)待选种质进行遗传多样性遗传背景分析，其具体步骤为：1)采用步骤(2)中筛选的多态性较好的引物或引物组合，例如：组合一AFS103-F、AFS099-1F；组合二AFS131-1F、AFS221；组合三22-F、19-F；组合四AFS111-F、AFS008-1F；组合五B20F12-F、17-F2)采用STR检测进行遗传多样性分析。确定STR位点，进行荧光标记选择，筛选的多态性引物合成和标记，荧光分子量内标的选用。3)PCR产物通过ABI3730XL测序仪器进行毛细管电泳检测，获得扩增片段大小的数据(如图1到图6所示)。4)采用GeneMapper3.2软件进行种质资源数据处理分析资源多样性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大葱种质资源创制和分析方法，其特征在于：/n有以下步骤：/n(1)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取待选大葱资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织提取基因组DNA。/n(2)设计、筛选大葱多态性SSR引物。/n(3)利用PCR扩增待选种质基因组DNA。/n(4)待选种质进行遗传多样性遗传背景分析。/n(5)结合田间形态表现和遗传多样性表现选定目标种质，制定种植资源利用策略。/n(6)田间栽培选定目标性状种质，调整育种策略中配置杂交组合的亲本花期，使其适期相遇，进行人工授粉。/n(7)收获杂种F1，进行性状鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种大葱种质资源创制和分析方法，其特征在于：
有以下步骤：
(1)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取待选大葱资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织提取基因组DNA。
(2)设计、筛选大葱多态性SSR引物。
(3)利用PCR扩增待选种质基因组DNA。
(4)待选种质进行遗传多样性遗传背景分析。
(5)结合田间形态表现和遗传多样性表现选定目标种质，制定种植资源利用策略。
(6)田间栽培选定目标性状种质，调整育种策略中配置杂交组合的亲本花期，使其适期相遇，进行人工授粉。
(7)收获杂种F1，进行性状鉴定。


2.根据权利要求1所述的一种大葱种质资源创制和分析方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用试剂盒提取待选大葱资源基因组DNA的步骤为：
1)取样备选种质资源新叶与倒数第二叶之间假茎幼嫩组织2-3g。
2)采用Ezup柱式植物组织基因组DNA抽屉试剂盒(生工生物)提取DNA，检测OD260/OD280比值在1.8-1.9。
3)稀释DNA模板浓度至20-50ng/μl。


3.根据权利要求1所述的一种大葱种质资源创制和分析方法，其特征在于：所述步骤(2)中的设计和筛选步骤为：
1)利用PrimerPremier5.0,NCBI及前人研究设计SSR引物38对。
2)随机选择4个样品，进行SSR多态性引物筛选，获得多态性较好的10对引物。


4.根据权利要求3所述的一种大葱种质资源创制和分析方法，其特征在于：所述步骤(3)的扩增基因组的步骤为：
1)采用25u...

【专利技术属性】
技术研发人员：周红伟，孔小平，魏廷珍，苗增建，曹青莉，景慧，
申请(专利权)人：西宁市蔬菜技术服务中心，西宁奥来利农业开发有限公司，
类型：发明
国别省市：青海;63