本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用；步骤为：首先基于嗜盐古菌DYF 46的基因组获得编码基因hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；将重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，经培养、诱导表达后低温离心收集菌体，于细胞裂解液中进行重悬，经超声破碎、离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶，经凝胶过滤层析纯化后获得高纯度Hly。本发明专利技术得到的Hly具有优良的酶学特性，可应用于洗涤剂、废水处理、制药和环境修复等复杂、含盐的降解蛋白质的生产加工过程中。
【技术实现步骤摘要】
一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法及其应用。
技术介绍
已发现的嗜盐古菌来源的丝氨酸蛋白酶前体均具有信号肽、前肽、催化结构域和C端延伸区(CTE)。前体分子通过TAT途径分泌至胞外，随后信号肽被切除，N端前肽帮助酶形成正确构象后被切除，最终形成成熟胞外蛋白酶。成熟的胞外蛋白酶由催化结构域和CTE组成，CTE可能与维持酶在高盐环境的稳定性或与大分子底物的结合有关。目前，很多细菌来源的蛋白酶无法适应高盐碱的工业加工环境，嗜盐古菌来源蛋白酶虽然能够耐受盐碱环境，但它们大多需要较高2-5MNaCl浓度来维持酶的稳定性。例如，来源于嗜盐古菌的胞外蛋白酶172P1在5％的NaCl浓度下完全失活；由Halogeometricumborinquense所产的胞外蛋白酶至少需要1MNaCl维持酶的稳定性；来自Natronococcusoccultus的胞外蛋白酶则需要2MNaCl维持酶的稳定性。因此，挖掘能够在低盐到高盐条件下均能发挥活性的耐盐蛋白酶十分必要。本专利技术涉及的新型丝氨酸蛋白酶基因所编码的新型丝氨酸蛋白酶不含嗜盐古菌胞外蛋白酶中广泛存在的CTE，并且在低盐环境下具有很高酶活且在高盐环境下也具有很好的稳定性，可以适应复杂工业加工过程，如精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，提供一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶编码基因、新型嗜盐古菌胞外蛋白酶及其应用，此蛋白酶可用于广泛盐浓度、pH和温度条件下蛋白质及肽类的降解。本专利技术基于嗜盐古菌Haladaptatussp.DYF46的基因组获得一种新型胞外蛋白酶编码基因hly(下文简称hly)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，基因大小为1191bp。hly编码的新型嗜盐古菌胞外蛋白酶Hly(下文简称Hly)的前体与以往发现的嗜盐古菌胞外蛋白酶均不同，具有信号肽、前肽和催化结构域，无CTE。Hly前体由396个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。为了实现以上目的，本专利技术包括以下步骤：本专利技术涉及了新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，具体包括以下步骤：(1)构建hly-pET28a重组表达质粒：首先基于嗜盐古菌(Haladaptatussp.)DYF46的基因组获得一种新型胞外蛋白酶编码基因hly，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；所述载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核表达载体，如pET系列载体，pQE系列载体，本专利技术具体选择大肠杆菌表达载体pET28a；(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：将步骤(1)得到的重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述原核生物宿主为E.coliBL21(DE3)；转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至生长对数期，达到一定OD600值时，添加IPTG诱导剂，继续培养一段时间进行诱导表达；诱导表达之后，低温离心收集菌体；(3)Hly的复性、纯化：收集步骤(2)诱导表达后的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶；最后利用凝胶过滤层析进一步纯化蛋白，获得高纯度Hly。优选的，步骤(1)中所述嗜盐古菌(Haladaptatussp.)DYF46保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CGMCC19759，保藏日期：2020年4月29日。优选的，步骤(1)中所述hly核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，基因大小为1191bp。优选的，步骤(1)中所述酶切位点选择限制性内切酶NcoI和XhoI的酶切位点。优选的，步骤(2)中所述卡那霉素在LB液体培养基中的终浓度为50μg/mL。优选的，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃。优选的，步骤(2)中所述一定OD600值为0.55～0.65；所述添加IPTG诱导剂的终浓度为0.5mM。优选的，步骤(2)中所述继续培养一段时间为4～5h，温度为37℃；所述低温为0～4℃。优选的，步骤(3)中所述获得成熟酶的具体操作为：首先20倍柱床体积的细胞裂解液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，用于平衡镍柱；于上清液中加入终浓度为2mM的β-巯基乙醇，上样；然后使用缓冲液I洗脱杂蛋白；在镍柱中加入5倍柱床体积的复性缓冲液，并将镍柱置于37℃保温24h；流尽复性缓冲液后，缓冲液II洗脱杂蛋白；再加入5倍柱床体积的洗脱液I得到成熟酶，记为Hly。优选的，所述细胞裂解液成分为8M尿素，10mMCaCl2，50mMTris-HCl，pH8.0。优选的，所述缓冲液I成分为2mMβ-巯基乙醇，8M尿素，40mM咪唑，10mMCaCl2，50mMTris-HCl，pH8.0。优选的，所述复性缓冲液成分为2MNaCl，10mMCaCl2，50mMTris-HCl，pH8.0。优选的，所述缓冲液II成分为2MNaCl，20mM咪唑，10mMCaCl2，50mMTris-HCl，pH8.0。优选的，所述洗脱液I成分为2MNaCl，250mM咪唑，10mMCaCl2，50mMTris-HCl，pH8.0。优选的，步骤(3)中所述凝胶过滤层析所用的流动相为复性缓冲液。本专利技术还提供了Hly在工业上的应用，例如可用于催化蛋白类底物水解，具体包括对偶氮酪蛋白为代表的大分子蛋白质底物和小分子四肽底物的催化作用：(1)以偶氮酪蛋白为底物测定Hly的催化活性的方法为：以酶活测定缓冲液溶解0.2mM偶氮酪蛋白底物，以酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶至20μL；20μL酶液和20μL底物于37℃反应1h，20μL酶液于反应结束后再加入20μL底物作为空白对照；加入40μL10％TCA终止反应；静置30min，离心所得上清液与1MNaOH以1:1比例混合后，采用紫外可见光分光光度计测定吸光值A440；以偶氮酪蛋白在该波长下的消光系数计算转化底物浓度；一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟转化lμmol偶氮酪蛋白所需要的酶量。2MNaCl、37℃且pH8.0条件下测得的以偶氮酪蛋白为底物的Hly比酶活为1430U/mg。(2)以四肽Suc-AAPF-pNA为底物测定Hly的催化活性的方法为：使用酶活测定缓冲液稀释0.1μg纯酶至300μL，并配制0.4mMSuc-AAPF-pNA底物。利用蛋白核酸分析仪DU800的kinetics/time方法，反应温度为37℃；以300μL底物和300μL酶液为实验组，300μL缓冲液和300μL酶液为空白对照组；记录10min内初始反应速率。通过Suc-AAPF-pNA410nm波长下消光系数计本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)构建hly-pET28a重组表达质粒：首先基于嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46的基因组获得一种胞外蛋白酶编码基因hly，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；所述载体为大肠杆菌表达载体pET28a；所述嗜盐古菌(Haladaptatus sp.)DYF 46保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC 19759；/n(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：将步骤(1)得到的重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述原核生物宿主为E.coli BL21(DE3)；/n转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至生长对数期，达到一定OD
【技术特征摘要】
1.一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建hly-pET28a重组表达质粒：首先基于嗜盐古菌(Haladaptatussp.)DYF46的基因组获得一种胞外蛋白酶编码基因hly，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hly；通过分子克隆技术将hly连接到载体上构建重组质粒；所述载体为大肠杆菌表达载体pET28a；所述嗜盐古菌(Haladaptatussp.)DYF46保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC19759；
(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：将步骤(1)得到的重组质粒转化原核生物宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述原核生物宿主为E.coliBL21(DE3)；
转化后的重组宿主细胞在含有卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至生长对数期，达到一定OD600值时，添加IPTG诱导剂，继续培养一段时间进行诱导表达；诱导表达之后，低温离心收集菌体；
(3)收集步骤(2)诱导表达后的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化蛋白结合柱上复性方法获得成熟酶；最后利用凝胶过滤层析进一步纯化蛋白，获得高纯度Hly。
2.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述卡那霉素在LB液体培养基中的终浓度为50μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述一定OD600值为0.55～0.65；所述添加IPTG诱导剂的终浓度为0.5mM。
【专利技术属性】
技术研发人员：崔恒林，赵阳洁，侯靖，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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