一种鼻咽癌早期筛查、诊断试剂及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鼻咽癌早期诊断试剂，它至少包含一种氨基酸序列如ＳＥＱ　ＮＯ．２所示的蛋白或其与ＧＳＴ蛋白的融合蛋白。本发明专利技术还提供了一种制备氨基酸序列如ＳＥＱ　ＮＯ．２所示的蛋白或其与ＧＳＴ蛋白的融合蛋白的方法。本发明专利技术的诊断试剂盒为鼻咽癌以及其它ＥＢ病毒相关疾病的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标，为早期筛查和诊断鼻咽癌及其它ＥＢ病毒相关疾病提供了一个新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌症诊断试剂，具体地，本专利技术涉及含有EB病毒裂解复制期 早期基因BALF1序列表达产物的诊断试剂及其应用。
技术介绍
EB (Epstein-Barr)病毒是一种Y疱疹病毒，全球接近95%的成人感染 有该病毒。EB病毒感染可分为潜伏感染期和裂解复制期两种状态，在初次 感染后，该病毒可在宿主体内建立起终身潜伏感染，持续性的EB病毒裂解 复制状态感染可导致一系列的人类恶性肿瘤(Rickinson et al., 1996)。 EB病毒终生在口咽部产生并通过口腔传染，初始感染可引起传染性单核细 胞增多症，多发于儿童和年轻成人。经多年研究发现EB病毒与鼻咽癌、胃 癌、肺癌以及一系列常见淋巴瘤均有相关。其中鼻咽癌与EB病毒关系最为 密切，近年来通过对肿瘤上皮细胞中的病毒基因组与抗原的检测证实了二者 的密切相关性(ZurHausenetal.,1970;Yeungeta1. 1993)。鼻咽癌是东南亚地区 常见肿瘤，与食道癌、肝癌并称中国三大肿瘤，且高发于我国南方数省，在 南方各种恶性肿瘤中占第一位。对于EB病毒相关肿瘤控制的主要策略为1、 早期检测诊断后进行治疗，2、将疾病的发生理想的推迟至平均寿命之外，3、 预防。由于EB病毒无法单独在体外培养，而大量细胞培养以及纯化带来的 困难和不安全因素使直接从形态学检测EB病毒很难在临床上实现，更无法 应用于大规模筛査工作。因此早期诊断多应用病毒特异性的抗原、抗体或遗 传物质对EB病毒相关肿瘤进行早期诊断是目前控制EB病毒相关肿瘤行之 有效的方法，现在诊断EB病毒相关疾病的主要指标为EB病毒壳抗原 (VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗体。其中EBNA1在 EB病毒潜伏期和裂解期均有表达，目前研究表明，虽然大多数人感染EB病 毒，但多属于潜伏期感染，而裂解期感染指病毒大量活跃复制，此类型感染与EB病毒所致恶性肿瘤密切相关，因此该抗原的特异性不理想；而VCA与EA虽然在NPC病人中检出率高，但其特异性也不好，在健康人群中仍有较 高的检出率。因此选择灵敏度与特异性好的检测指标是现在本研究领域急需 解决的问题之一。基于持续性的EB病毒裂解复制状态感染与一系列的人类恶性肿瘤密切 相关的认识，选择EB病毒列解期表达产物作为检测指标可能是好的选择。 现有的EB病毒的裂解期表达产物主要包括BALF1、 BLLF1、 BXLF2、 BALF4、 B0RF2、 BARF1、 BALF5及BZLF1等基因的表达产物。但是，制备疾病检测试 剂盒，除了需要表达的蛋白在免疫沉淀反应中抗体滴度效价很高外，蛋白还 要足够的稳定，目前并未有研究表明它们可以作为鼻咽癌及相关疾病的良好 的检测试剂。BALF1基因位于EB病毒基因组164397 165059位置，是EB病毒进入裂解 复制状态早期表达的早期基因，长度为663bp， 1999年由Marshall发现该基因 与人类Bcl2家族具有同源性。BALF1基因编码蛋白具有凋亡抑制作用，能够 抑制感染的上皮细胞进入凋亡(Dawsonetal., 1995)。有研究表明BALF1基因 能够在B淋巴细胞以及上皮细胞中表达相应蛋白，在EB病毒潜伏期仅少量表 达，但一旦病毒进入裂解期，蛋白表达量明显增高。目前尚未见使用BALF1基因表达产物作为抗原，作为鼻咽癌早期筛査 和诊断试剂的研究和报道。
技术实现思路
本专利技术针对上述本领域急需解决的问题，利用EB病毒裂解复制期早期基 因BALF1的生物学特性，提供了具有高灵敏度和特异性的，可应用于诊断EB 病毒相关疾病以及大规模人群筛査的新型检测指标及方法。本专利技术提供一种试剂盒，它至少包含一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示 的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白。进一步的，所述试剂盒含有氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白或其与 GST蛋白的融合蛋白。所述试剂盒用于鼻咽癌及相关疾病的早期诊断、筛查和检测；优选的，所述试剂盒采用ELISA技术。本专利技术还提供一种制备氨基酸序列如SEQNO. 2所示的蛋白或其与GST 蛋白的融合蛋白的方法，包括a、构建含有SEQ N0.3核苷酸序列的重组质粒；b、将重组质粒转入宿 主细胞；c、收集得到含有SEQN0.2所示氨基酸序列的表达产物粗提物；d、 纯化表达产物粗提物，得到氨基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白或其与GST 蛋白的融合蛋白；e、将d步骤得到的纯化蛋白进行二次纯化。上述的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白，即BALF1蛋白；或其与 GST蛋白的融合蛋白，即GST-BALF1融合蛋白，这两种蛋白质分子的灵敏度 与特异性均较好，作为检测试剂没有显著差异，为鼻咽癌以及其它EB病毒相 关疾病的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标。所述的方法中，步骤a所述的质粒载体为PGEX系列或PET系列的蛋白 表达载体；步骤b所述的宿主细胞为E.coli.BL21、 DH5a或JM109;步骤d所述的纯化方法为将收集的表达产物粗提物，用Glutahione Sepharose 4B或亲和层析柱纯化，Xa因子储存液，Xa因子剪切缓冲液洗脱 离心，或者用谷胱甘肽洗脱液，离心，得到纯化的氨基酸序列如SEQ NO. 2 所示蛋白；步骤e所述的纯化方法为透析法、离子交换层析法以及HPLC-分子筛层 析法。优选的，步骤e所述的纯化方法为HPLC-分子筛层析法，所使用的层析 柱为Sepharose-lOO。我们在使用步骤6或7后保存一段时间后(5h)电泳分析发现蛋白质有 降解现象。因此我们认为可能有其他物质影响了所获得蛋白的稳定性。我们 采用了不同的方法(透析法，离子交换层析法以及HPLC-分子筛方法)，对蛋 白进行了再次纯化并通过电泳分析比较保存一段时间后的降解情况。最终认 为使用HPLC-分子筛的方法进行再次纯化获得的蛋白稳定性最好，因此我们 使用HPLC-分子筛获得更为稳定的目的蛋白的方法并非显而易见的方法。经过本专利技术的方法制备得到的高度纯化的BALF1蛋白GST-BALF1融合蛋白在室温下保存12小时没有发生降解，为制备试剂盒提供了可能。而以这两 种蛋白制备的试剂盒，对鼻咽癌以及其它EB病毒相关疾病的诊断和筛査，其 灵敏度与特异性均很好。附图说明图1 PGEX-BALF1质粒构建示意图。图2 GST-BALF1融合蛋白在HPLC-分子筛纯化前后不同保存时间电泳图 (室温下保存，20°C)。白色箭头所示为目的蛋白。泳道1为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存O 小时电泳图，2为HPLO分子筛纯化前蛋白质保存5小时电泳图，3为HPLO 分子筛纯化后0小时电泳图，4为HPLC-分子筛纯化后保存12小时电泳图。M 为marker。图3 BALF1蛋白在HPLC-分子筛纯化前后不同保存时间电泳图(室温下 保存，20°C)。白色箭头所示为目的蛋白。泳道l为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存O 小时电泳图，2为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存5小时电泳图，3为HPLC-分子筛纯化后0小时电泳图，4为HPLC-分子筛纯化后保存12小时电泳图。M 为marksro图4正常组与NPC病人组检测结果进行R0C分析的结果。图5 65例被测样本的VCA抗体浓度小于8 U/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，它至少包含一种氨基酸序列如ＳＥＱ　　ＮＯ．２所示的蛋白或其与ＧＳＴ蛋白的融合蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏永刚，李波，应斌武，范红，王兰兰，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]